材料和试剂

来自年轻健康的拟南芥植物的花序
琼脂平板，用1/2x Murashige和Skoog固体培养基
果胶酶（Sigma-Aldrich，目录号：P3026）
纤维素酶（Sigma-Aldrich，目录号：C1184）
β-葡萄糖醛酸酶（Roche Diagnostics，目录号：03707598001）
蔗糖（Affymetrix，目录号：21938）
乙醇（EMD Millipore，目录号：1085430250）
氯仿（EMD Millipore，目录号：102442）
冰醋酸（EMD Millipore，目录号：100063）
无水柠檬酸（Affymetrix，目录号：13729）
柠檬酸钠二水合物（Affymetrix，目录号：13735）
甲酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：F9037）
盐水 - 柠檬酸钠（SSC）（Sigma-Aldrich，目录号：S0902）
硫酸葡聚糖（Sigma-Aldrich，目录号：42867）
鲑鱼精子（Life Technologies，目录号：15632-011）
（Vector Laboratories，目录号：H-1400）的VECTASHIELD 安装介质中。
荧光素High-Prime标记试剂盒（Roche Diagnostics，目录号：11585622910）
pAL1着丝粒探针（ABRC，目录号：CD3-16）
使用标准Taq 缓冲液（New England Biolabs，目录号：M0273S）进行Taq DNA聚合酶
QIAquick凝胶提取试剂盒（用于从凝胶纯化DNA的试剂盒）（QIAGEN，目录号：28704）
Gel Pilot 1 Kb Ladder（DNA的分子量标记）（QIAGEN，目录号：239085）
琼脂糖电泳（Bio-Rad Laboratories，目录号：BR161-3100）
Carnoy的解决方案（见配方）
10 mM柠檬酸钠缓冲液（参见配方）
酶消化缓冲液（参见配方）
FISH缓冲区（参见配方）
10x PBS（请参阅配方）
20x SSC（请参阅配方）

设备

皮下注射针和注射器（Terumo Medical Corporation，型号：26G×1/2"，目录号：NN-2613R）
镊子（杜蒙）
聚-L-赖氨酸包被的载玻片（Sigma-Aldrich，目录号：P0425-72EA）
Nunc Lab-Tek II载玻片（Thermo Fisher Scientific，目录号：154453）
盖玻片（Matsunami Glass，目录号：C218181）
杂交炉OV1（Biometra，目录号：052-090）
热循环仪（Biometra，目录号：050-551）
干块（Thermo Fisher Scientific，Reacti-Therm ）
-86℃冰箱（Thermo Fisher Scientific，型号：Forma 88000）
Frigidaire -20℃冰箱（Frigidaire，型号：FCFS201LFB）
荧光显微镜
Coplin染色瓶（Thermo Fisher Scientific，目录号：107）
Rubbermaid LunchBlox ^®食品容器
Super Pap Pen液体阻滞笔（Electron Microscopy Sciences，目录号：71310）（可选）

程序

拟南芥减数分裂染色体扩散的制备
注意：这个实验的最重要的方面是收集花蕾在正确的阶段，以隔离包含男性meiocytes的花药。通常花芽进入消旋，只有3-4是可用的。它们的尺寸不能超过Terumo ^？ 26G x½"皮下注射针（约1mm）的嘴长度的1/4。花药应为绿色。为了准备一张幻灯片，需要5-10个花蕾。
1. 在花药收集和固定之前，从冰箱中取出酶消化溶液，并使其在冰上解冻。同时将杂交炉设置在37℃，并制备其中底部被潮湿组织覆盖的饭盒。在午餐盒的底部放置用于PCR管的架，并将载玻片放置在顶部，以避免与湿组织直接接触。花药的消化允许将自由的细胞释放到载玻片上，在显微镜下可以染色和观察。
2. 将总状花序首先置于1/2x Murashige和Skoog琼脂平板上。用镊子切除花芽，然后置于Lab-Tek II载玻片的一滴双蒸水（20μl）中。 Lab- Tek ^® II载玻片对于这个实验是完美的，因为它们的涂层使水滴保持在原位，而正常的聚-L-赖氨酸载玻片不能做到。
3. 要清除水或任何其他溶液，将针头压在滑块上，缓慢提起注射器的活塞（在将注射器靠在滑块上之前，活塞可以稍微提起）。选择一个远离芽的区域。如果可能，使用镊子将液滴从芽上拉开
4. 一旦所有的花蕾都放在水上，工作就可以开始了。将个体花蕾移动到载玻片内的干燥区域上。 10秒后，芽主要变干，可以轻松解剖。为了解剖，使用两个工具：镊子和两个皮下注射针（26G×1/2"）。将花芽水平放置，并用针在基部切割。这允许快速移除花瓣。一旦瓣被移除，花药可以借助于针而单独地移动到一滴水中。重要的是保持针干燥以允许容易地操纵剩余的花药。黄色花药不是减数性花药，不应该使用。花药必须始终保持湿润。
5. 一旦花药都放在一起，水被去除，只留下5微升。以这种方式，所有芽可以进一步与针聚集。然后添加Carnoy的固定剂20微升20分钟，每5分钟补充，以避免蒸发（作为一个选项超级Pap笔的液体阻滞笔可以用于更好地包含Carnoy的固定剂）。 Carnoy的固定剂不含甲醛，戊二醛或氯仿，因此它几乎没有毒性，并允许随后易于操作。 20分钟后，固定剂被移除，但留下至少5微升。聚集花药。然后迅速加水，并迅速删除（但从不完全，离开5微升）。然后再换水两次（每次5分钟）。
6. 加入柠檬酸盐缓冲液（20μl）。该缓冲液用于制备用于酶消化的花药。
7. 去除柠檬酸盐缓冲液后，向载玻片添加20-40μl酶溶液，将一个Lab-Tek ^® II塑料盖放在载玻片的顶部（每个载玻片带有盖），将载玻片在饭盒内，关好它，并将其放置在杂交炉内。允许芽在37℃下消化2小时。一旦消化完成，删除幻灯片，并删除大部分的溶液（留5μl）。然后快速加入20微升柠檬酸盐缓冲液，并迅速删除（从不完全，离开5微升），然后更改柠檬酸盐缓冲液两次（每次5分钟），并留下只有10微升在幻灯片上。缓慢小心地除去柠檬酸盐缓冲液。如果柠檬酸盐被去除太快，大多数花药也将被去除，并且载玻片可能含有很少或没有减数分裂的扩散。
8. 此时使用针，或镊子挤压花药。这允许将游离的毛细胞释放到载玻片上。慢慢地，大约10分钟。重要的是慢慢地仔细挤压;否则花药会相互粘附。此时溶液会变浑浊，这是正常的。如果需要，添加缓冲区。
9. 加入20μl的60％乙酸，慢慢混合。解决方案将变得透明。不允许蒸发。乙酸引起毛细胞肿胀，从而提高最终染色体扩散的质量。转移5微升的所得细胞悬浮液到四个不同的聚-L-赖氨酸幻灯片。将玻璃盖玻片放置在顶部，但在放置之前仔细错开盖玻片45度到任一侧，以允许一个角的突出。折叠一张纸巾并将幻灯片放在里面，然后用拇指从上面用力按压。保持你的拇指到位以防止盖玻片的位移是非常重要的。施加压力允许细胞破裂和去除细胞质，而使用纸巾防止载玻片在从上方施加压力时断裂。
10. 将载玻片移动到-80°C冰箱，并留在那里至少10分钟。然后迅速拿出来，并用剃刀帮助除去盖玻片。让载玻片在室温下风干。
11. 一旦幻灯片干燥添加5-30微升的DAPI解决方案（vectashield与封装介质例如）到4个幻灯片之一，并盖上一个新的盖玻片。观察一个幻灯片在荧光显微镜下，以确认幻灯片是否包含良好的减数分裂染色体扩散，如果这样，剩下的幻灯片可以用于FISH实验。可以使用图1作为模板鉴定减数分裂期（先前未公开）。您可以用常规指甲抛光器密封盖玻片的边缘，以便在黑暗中短期储存。 Vectashield包含允许短期存储的封装介质
  
  图1.通过DAPI染色显现的拟南芥中的男性减数分裂阶段。总是在中期I期间观察到。比例尺：A-D，20μm，E，F，H，5μm，G，I-L，10μm
FISH（荧光原位杂交）
1. 在2×SSC（700μl甲酰胺，100μl2×SSC和100μl蒸馏水）中制备70％甲酰胺。添加50微升到每个幻灯片，盖上盖玻片，将幻灯片放置在设置在80℃的热干燥块。 30秒后，您可以a）将幻灯片放在Coplin罐内的水上，以移除盖玻片，或b）应用20μl的水提起盖玻片。然后将载玻片置于装有200ml 70％，90％和100％乙醇的Coplin罐中，每个5分钟。请注意，所有乙醇溶液必须提前在-20°C冷却。浴系列完成后，让载玻片在室温下风干。
2. 同时准备pAL1着丝粒探针（对于这一步，你需要一个完全标记的探针）。探针浓度：20-30 ng /μl。溶解1.5μl在13.5μlFISH缓冲液（一个幻灯片），最终FISH探针浓度约2-3 ng /μl（见注释）。孵育探针在80℃下5-10分钟使DNA变性。之后立即用微量离心机（约10,000rpm）在室温下旋转。然后快速将FISH探针混合物置于冰上至少5分钟
3. 在每个载玻片上加入15μlFISH探针。盖上盖玻片，并在37°C下孵育午餐盒上的载玻片过夜。盒子底部应包含湿纸巾，以保持高湿度，避免FISH探针的干燥
4. 第二天早晨将载玻片浸在水上以除去盖玻片，然后将载玻片放在Coplin瓶子上。用200ml 2x SSC洗涤10分钟，四次。
5. 您可以通过拍摄一张幻灯片来检查幻灯片的状态，并用DAPI对其进行染色
6. 在200 ml热2x SSC（45°C）上洗涤载玻片10分钟，然后在200 ml 1 x PBS中5分钟。用PBS清洗不是必需的，可以跳过
7. 当样品湿润时，加入DAPI（5μl）。盖上盖玻片并观察。结果可以与图2（先前未公开）比较。
8. 如果由于某些原因细胞被洗掉，你可以在2x SSC上洗涤细胞15分钟一次，然后用DAPI直接染色。
  
  拟南芥拟南芥男性减数分裂（zygotene阶段）与pAL1着丝粒180bp重复（黄色）杂交并用DAPI （红色，假色）。着丝粒信号（4）的数量大致对应于二价物的实际数量（5）。比例尺：10μm

笔记

如何准备着丝粒探针
为了制备着丝粒探针，必须用特异性引物（正向和反向的M13）进行PCR。使用含有着丝粒的质粒pAL1作为模板，需要这两个引物用于扩增拟南芥180bp着丝粒重复。引物如下：
M13-正向：5'-GTAAAACGACGGCCAG-3'
M13-反向：5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'
通常，将pAL1质粒稀释1/100x进行PCR，所得产物用荧光素High-Prime标记试剂盒标记8小时。请仔细阅读制造商的说明。

食谱

Carnoy溶液（v/v）
95％乙醇，氯仿和冰醋酸（6:3:1）洗脱
1升10mM柠檬酸钠缓冲液 1.045g无水柠檬酸（MW = 192.12） 1.479柠檬酸钠二水合物（MW = 294.1）
酶消化缓冲液
0.3％果胶酶Y23,1.5mg（0.0015g） 0.3％纤维素酶，1.5mg（0.0015g） 1.4％β-葡萄糖醛酸酶，7.5mg（0.0075g） 6％蔗糖，30mg（0.03g）首先溶解酶在10mM柠檬酸钠（100μl）中，然后继续加入柠檬酸钠至500μl。该溶液可在-20°C下储存一个月。
FISH缓冲液（500μl）
10％甲酰胺（加入50μl100％甲酰胺） 2×SSC（加50μl20×SSC） 10％硫酸葡聚糖（加入100μl50％硫酸葡聚糖，通过简单地将1g硫酸葡聚糖粉末溶解在2ml蒸馏水中制备，然后加热至80℃以改善混合）鲑鱼精子阻断DNA（加入75μl25x精子，最终浓度：250μg/μl）
为了制备25x鲑鱼精子DNA（25μg/μl），将250mg精子粉末溶解于1ml蒸馏水或1x PBS中
保持在-20°C
0.1％SDS（加5μl10％SDS）蒸馏水，220μl
10x磷酸盐缓冲盐水（PBS）
制备NaCl，80g; KCl，2g; Na 2 HPO 4 sub。7 7H 2 O，14.4g;实施例1的化合物。 KH 2 PO 4 4，2.4g; ddH <2> O高达1000ml
将pH调节至7.2-7.6
高压灭菌器
20x SSC
制备175.3g（3M）的NaCl和88.2g（300mM）柠檬酸钠二水合物，然后溶解在800ml水中
将pH调节至7.0
取体积到1000 ml
高压灭菌器

致谢

这项工作得到了中国台湾研究院，台湾农业生物技术国家科技计划（NSTP/AB，098S0030055-AA）和国家科学委员会（NSF; 99-2321-B-001 -036-MY3），台湾，到G.-Y.高雅一个NSF资助（MCB0718191）给C.A.Makaroff，以及一个从哥斯达黎加大学到P.Bolaños-Villegas的留学合同。

参考文献

Bolaños-Villegas，P.，Yang，X.，Wang，H.J.，Juan，C.T.，Chuang，M.H.，Makaroff，C.A。和Jauh，G.Y。 DNA需要拟南芥色素发酵蛋白7（AtCTF7/ECO1）修复，有丝分裂和减数分裂。植物J 75（6）：927-9。
Yang，X.，Boateng，K.A.，Yuan，L.，Wu，S.，Baskin，T.I.和Makaroff，C.A。（2011）。径向肿胀4 分离酶突变的拟南芥（Arabidopsis thaliana）阻断染色体断裂并破坏微生物中的径向微管系统。 6（4）：e19459。