材料和试剂

〜5×10 6个MDCK细胞（ATCC，目录号：CCL-34）
0.05％1×胰蛋白酶-EDTA（酚红）（Life Technologies，目录号：25300054）
DPBS（Life Technologies，目录号：14190-250）
抗HA抗体（大部分是自制的）
nProtein A Sepharose 4 Fast Flow（GE，目录号：17-5280-02）
4x NuPAGE LDS样品缓冲液（Life Technologies，目录号：NP0007）
NuPAGE Novex 4-12％Bis-Tris蛋白凝胶（Life Technologies，目录号：NP0321PK2）
NuPAGE MES SDS运行缓冲液（Life Technologies，目录号：NP000202）
没有甲硫氨酸和半胱氨酸的DMEM培养基（Life Technologies，目录号：21013024）
无EDTA蛋白酶抑制剂混合物（Roche Diagnostics，目录号：04693159001）
10％Triton X-100表面活性剂洗涤剂溶液（Thermo Fisher Scientific，目录号：28314）
UltraPure 1M Tris-HCl缓冲液（pH7.5）（Life Technologies，目录号：15567-027）
UltraPure 5M NaCl（Life Technologies，目录号：24740-011）
UltraPure 0.5M EDTA（pH 8.0）（Life Technologies，目录号：15575-020）
甲醇（Sigma-Aldrich，目录号：322415）
乙酸（Sigma-Aldrich，目录号：320099）
DMEM培养基（Life Technologies，目录号：10569-010）
具有7.5％胎牛血清的DMEM培养基（参见Recipes）
脉冲介质（见配方）
Chase介质（见配方）
非变性裂解缓冲液（参见配方）
固定解决方案（参见配方）
L-半胱氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：W326305）（参见Recipes）
[PerkinElmer，目录号：NEG-709-A005MC]（参见配方）。
L-甲硫氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：M9625）（参见Recipes）

设备

注意：指定用于使用放射性材料。

按照当地辐射安全指南处理液体和固体的适当容器[³⁵ S] -
T-75组织培养瓶（Thermo Fisher Scientific）
50ml BD Falcon管（BD Biosciences，Falcon ）
设置在37℃的水浴
冷冻微型离心机
用于1.5ml微量离心管的旋转器在4℃下固定
1.5 ml微量离心管
运行微型凝胶的小室[我常规使用XCell SureLock Mini Cell电泳系统（Life Technologies，目录号：EI0001）。]
Carestream Kodak BioMax MR膜（Sigma-Aldrich，目录号：Z350400）
柯达X-OMAT 2000A处理器
凝胶干燥器
用于放射自显影的暗盒

程序

放射性脉冲追踪
1. 分离MDCK细胞[在T-75组织培养瓶中生长，并在37℃下用10个感染剂量的流感A /波多黎各/8/34（PR8）病毒每个细胞感染5小时（Magadan等，，2013）] 在37℃下用5ml胰蛋白酶-EDTA孵育约15分钟
2. 转移细胞到50ml BD Falcon管，并用10ml预热的DPBS通过在室温下以2,500×g离心1分钟洗涤它们两次。
3. 重悬细胞在1 ml DPBS，并将其转移到1.5毫升微量离心管。
4. 离心细胞15秒，最高速度，4℃
5. 重悬细胞在200微升的预热脉冲介质
6. 在37℃水浴（脉冲）孵育细胞2分钟
7. 离心细胞15秒，最高速度，4℃
8. 吸出上清液，并在1.05ml预热的追踪培养基中重悬细胞沉淀
9. 在37℃下，在水浴中孵育标记的细胞达20分钟
10. 在0,5,10,15和20分钟取每份190μl的等分试样，立即将其转移到含有1ml冰冷的DPBS的新的1.5ml微量离心管中。
11. 离心细胞15秒，最高速度，4℃
12. 吸出上清液，并在1ml冰冷的非变性裂解缓冲液中重悬细胞沉淀
13. 孵育细胞裂解液30分钟，在4°C，慢旋转
14. 通过在4℃下以最大速度离心15分钟来澄清细胞裂解物
15. 保持上清液，但丢弃沉淀。
免疫沉淀
1. 通过在3,000xg，4℃下离心1分钟，用0.5ml冰冷的DPBS洗涤30μl蛋白A琼脂糖/每个追踪时间点两次。
2. 将树脂重悬于补充有0.001％Triton X-100和所选抗HA抗体的0.5ml冰冷的DPBS中。
3. 在4℃下缓慢旋转孵育至少2小时。
4. 用0.5ml冰冷的非变性裂解缓冲液（无蛋白酶抑制剂）洗涤树脂两次
5. 加入10μl10％BSA
6. 添加从每个追逐时间点清除的细胞裂解物。
7. 在4℃下缓慢旋转孵育至少2小时。
8. 用0.5ml冰冷的非变性裂解缓冲液（无蛋白酶抑制剂）洗涤树脂两次，但含有0.1％而不是0.5％Triton X-100。
9. 用0.5ml冰冷的DPBS洗涤树脂一次。
10. 将树脂重悬在20μl的4x LDS样品缓冲液中
11. 煮沸样品5分钟。
SDS-PAGE和荧光成像
1. 加载15微升的每个样品到蛋白质小凝胶上
2. 在恒定的50mA /凝胶下运行〜3小时
3. 用10ml固定溶液在室温下用慢摇动固定凝胶至少30分钟
4. 在凝胶干燥器中在80℃下干凝胶1.5小时（在1mm凝胶的情况下）
5. 在室温下将膜暴露于放射性凝胶过夜。
6. 我通常使用Kodak X-OMAT 2000A处理器开发我的电影
7. 请参阅我们之前的出版物（Magadan等人，2013年）的图1，了解具有代表性的结果和结论。

食谱

含7.5％胎牛血清的DMEM培养基补充含7.5％胎牛血清的DMEM培养基，通过向500ml液体培养基中加入约40ml商业原液
脉冲介质
没有添加0.20mM L-半胱氨酸和0.2mCi/ml [35 S] - 蛋氨酸的甲硫氨酸和半胱氨酸的DMEM培养基
追逐媒体
补充有7.5％胎牛血清和67mM L-甲硫氨酸的DMEM培养基
非变性裂解缓冲液
0.5％Triton X-100 50mM Tris-HCl（pH7.5） 300 mM NaCl
5 mM EDTA
完全微型，无EDTA蛋白酶抑制剂混合物
固定溶液
50％甲醇
10％乙酸
L-半胱氨酸
将12.116mg商业粉末溶解在不含甲硫氨酸和半胱氨酸的500ml DMEM培养基中，得到补充有0.20mM L-半胱氨酸的新培养基。
[s] 35 S] - 甲硫氨酸将19.6μl5 mCi/0.49 ml储备溶液加入1 ml不含蛋氨酸的DMEM培养基中，得到0.2 mCi/ml工作溶液。
L-甲硫氨酸将10mg商品粉末溶解在1ml DMEM培养基+ 7.5％胎牛血清中，得到补充有67mM L-甲硫氨酸的追加培养基

致谢

该协议已经改编自以前发表的论文（Magadan等人，2013年）。这项工作是由国家研究所的过敏和传染病，国家卫生研究院的校内研究支持。

参考文献

Magadan，J.G.，Khurana，S.，Das，S.R.，Frank，G.M.，Stevens，J.，Golding，H.，Bennink，J.R.and Yewdell，J.W。（2013）。甲型流感病毒血凝素三聚化完成单体折叠和抗原性。/em> 87（17）：9742-9753。