材料和试剂

来自流感A /波多黎各/8/34（PR8）病毒（Magadan等人，2013）的三聚体重组HA（recHA 3）
凝胶过滤蛋白标准[碳酸酐酶（29kDa），卵白蛋白（43kDa），伴白蛋白（75kDa），醛缩酶（158kDa）和铁蛋白（440kDa）]（GE，目录号：28-4038-41和28 -4038-42）
4x NuPAGE LDS样品缓冲液（Life Technologies，目录号：NP0007）
NuPAGE Novex 4-12％Bis-Tris蛋白凝胶（Life Technologies，目录号：NP0321PK2）
NuPAGE MES SDS运行缓冲液（Life Technologies，目录号：NP000202）
Ponceau S溶液（Sigma-Aldrich，目录号：P7170）
5％乙酸
印迹级阻断剂脱脂奶粉（Bio-Rad Laboratories，目录号：170-6404XTU）
1x PBS（Life Technologies，目录号：AM9624）
Tween-20（Sigma-Aldrich，目录号：P1379）
对变性HA1（克隆CM-1）的自制的，构象独立的小鼠单克隆抗体
兔多克隆抗小鼠HRP缀合的抗体（Dako，目录号：P0260）
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate（Thermo Fisher Scientific，目录号：34077）
高纯度蔗糖（Thermo Fisher Scientific，目录号：NC0110097）
UltraPure 5M NaCl（Life Technologies，目录号：24740-011）
UltraPure 0.5M EDTA（pH 8.0）（Life Technologies，目录号：15575-020）
蔗糖梯度（参见配方）

设备

折射计（Bausch& Lomb Incorporated）
14×89mm Ultra Clear管（Beckman Coulter，目录号：344059）
Pipettor
1.5 ml微量离心管
装有SW41转子（Beckman Coulter）的超速离心机
硝酸纤维素印迹膜（0.45μm孔径）（Life Technologies，目录号：LC2000）
运行微型凝胶的小室[我常规使用XCell SureLock Mini Cell电泳系统（Life Technologies，目录号：EI0001）。]
Mini Bio-Blot Cell（Bio-Rad Laboratories，目录号：170-3930）
Carestream Kodak BioMax XAR膜（Sigma-Aldrich，目录号：F5388）
柯达X-OMAT 2000A处理器或等同设备
用于放射自显影的暗盒

软件

ImageJ软件（ http://imagej.nih.gov/ij/）

程序

蔗糖梯度上的区带沉降
1. 同时通过吸取它们（使用连接到移液器的10μl吸头）加载6μg的recHA 3和60μg的每种蛋白质标准品，恰好低于5-25％蔗糖梯度的顶部，其含有60 ％蔗糖垫。
2. 在4℃以35,000rpm超速离心蔗糖梯度16小时
3. 将含有蔗糖梯度的试管置于紧密贴合的架子中，以避免任何不希望的运动
4. 小心地将1毫升吸头连接到移液器正下方的蔗糖梯度的顶部。
5. 通过慢速移液手动收集250μl的馏分
6. 将馏分转移到新的1.5ml微量离心管中
7. 重复步骤A4和A6，直到蔗糖梯度完全分馏
8. 将每份15μl与5μl4x LDS样品缓冲液混合
9. 煮沸样品5分钟。
SDS-PAGE和Western印迹
1. 加载15微升的每个样品到蛋白质小凝胶上
2. 在恒定的50mA /凝胶下运行〜1小时
3. 转移蛋白质到硝酸纤维素膜约1小时，在恒定的300毫安
4. 用10％0.1％Ponceau S在5％乙酸中的溶液染色膜5分钟。用水冲洗膜。在这一点上，可以在染色的膜上看到蛋白质标准
5. 扫描或拍摄染色膜的图片。
6. 在室温下用10 ml 5％脱脂奶粉/1 x PBS封闭膜30分钟
7. 在室温下用10ml 0.5％Tween-20/1×PBS洗涤膜10分钟，同时剧烈摇动
8. 用含有抗HA抗体的10ml纯净小鼠杂交瘤上清液在室温下用缓慢摇动孵育膜至少2小时。
9. 用10ml 0.5％Tween-20/1x PBS在室温下振荡洗涤膜3次，每次10分钟。
10. 孵育膜与10ml抗小鼠HRP缀合的抗体稀释1：3,000在5％脱脂奶/1 x PBS在室温下1小时，缓慢摇摆。
11. 用10ml 0.5％Tween-20/1x PBS在室温下振荡洗涤膜3次，每次10分钟。
12. 孵育膜与5毫升SuperSignal West Pico化学发光底物在室温下摇动5分钟。
13. 在室温下将膜暴露于膜
14. 使用Kodak X-OMAT 2000A处理器或等同设备制作胶片。
15. 请参阅我们之前的出版物（Magadan等人，2013年）上的图5，以获得有代表性的结果和结论。
recHA 3分子大小的计算
1. 使用Image J软件，用Ponceau S在染色的膜上测量每个蛋白质标准条带的强度。然后，绘制蛋白质标准品在不同蔗糖梯度馏分上的分布
2. 重复步骤C1，测量通过Western印迹获得的recHA亚基3的分布
3. 通过比较两个图，显然recHA 3（约200kDa）作为离散峰在含有醛缩酶（158kDa）的级分后立即沉淀。

食谱

蔗糖梯度
通过将高纯度蔗糖溶解在50mM Tris-HCl（pH 7.5）和100mM NaCl中制备60％蔗糖原料使用折射计（室温下RI = 1.4418）测量60％蔗糖溶液的折射率（RI）。
使用上述配方中的60％蔗糖储备溶液制备25％，22.5％，20％，17.5％，15％，12.5％，10％，7.5％和5％蔗糖溶液
在14×89mm试管中倒入2ml 60％蔗糖垫，然后通过小心吸移将1ml以下蔗糖溶液：25％，22.5％，20％，17.5％，15％，12.5％，10％％，和5％
在室温下平衡蔗糖梯度至少1小时

致谢

该协议已经改编自以前发表的论文（Magadan等人，2013年）。这项工作是由国家研究所的过敏和传染病，国家卫生研究院的校内研究支持。

参考文献

Magadan，J.G.，Khurana，S.，Das，S.R.，Frank，G.M.，Stevens，J.，Golding，H.，Bennink，J.R.and Yewdell，J.W。（2013）。甲型流感病毒血凝素三聚化完成单体折叠和抗原性。/em> 87（17）：9742-9753。