材料和试剂

4周龄和14周龄的FVB/n MMTV-PyMT雌性和用于分离正常乳腺成纤维细胞（NF）的MMTV-PyMT阴性兄弟姐妹（The Jackson Laboratory，目录号：002374）
Phoenix-Eco包装细胞（ATCC，目录号：CRL-3214）（阅读注释6了解更多信息）
pBabe-HPV-E6-嘌呤霉素质粒（或选择的永生化质粒，参见注释6）
注意：这是在我们的实验室生成的，但有替代品（pLenti-puro-HPV-16 E6/E7;应用生物材料，目录号：G268）。
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）（具有稳定的L-谷氨酰胺的高葡萄糖）（Life Technologies，Gibco ，目录号：41966-029）
50x丁酸钠（500mM）
（1,5-二甲基-1,5-二氮杂十一亚甲基聚甲溴化物，溴化己二甲铵）（Sigma-Aldrich，目录号：AL-118）（1000x溶液，2mg/ml）
胰岛素 - 转铁蛋白 - 硒（ITS）溶液（Life Technologies，目录号：51300-044）。
磷酸钙转染试剂盒（ProFection Mammalian Transfection System）（Promega Corporation，目录号：E1200）
胎牛血清（FBS）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）
没有Ca 2+ 2 + 和Mg 2+ 2 +
的PBS
青霉素/链霉素
EDTA（1mM，在不含Ca 2+和Mg 2+的PBS中）
10％福尔马林溶液，中性缓冲（10％NBF）
100x胶原酶/分散酶（100mg/ml）（Roche Diagnostics，目录号：11097113001）
1000x嘌呤霉素（2mg/ml）（Sigma-Aldrich，目录号：P9620）
1000x DNA酶I（10mg/ml）（Sigma-Aldrich，目录号：D4513）
胰蛋白酶/EDTA
Virkon（DuPont Rely + On Virkon，目录号：1235-8667）
完成媒体（见配方）

设备

0.22μm，0.45μm，3mm过滤器
20毫升盖玻片
组织培养塑料制品
37℃摇床
组织培养层流罩
10厘米组织培养皿
离心机
37℃，5％CO 2，细胞培养箱
解释器
外科剪刀
解剖仪器

程序

开始之前
1. 请阅读注释部分以获取指导。
2. 获得5和14周龄之间的MMTV-PyMT阳性雌性。
  注意：年龄和肿瘤阶段之间的相关性在其他肿瘤模型中可能不同。有关详情，请阅读说明部分。
3. 确保您拥有所有材料，试剂和设备。
解剖样本 - 肿瘤材料
1. 使用外科器械解剖来自第4和第9腹股沟腺的乳房组织。将组织保持在冰冷的PBS中直至进一步使用。
  注意：对于正常的乳腺分离，解剖10周龄的MMTV-PyMT阴性雌性的乳腺组织。为了分离增生性肿瘤，解剖6周龄的MMTV-PyMT阳性雌性的乳腺组织。为了分离腺瘤，癌和侵袭性癌，分别分析7,8和10周龄的MMTV-PyMT阳性雌性的乳腺组织（图1）。这些时间点可能不同。有关确定正确年龄和肿瘤分期的更多信息，请阅读方案结尾处的注2。
2. 将样品在无菌条件下移入层流组织培养罩中
3. 仔细分析组织样品，检查指示其肿瘤阶段的征兆。作为粗略的指导，正常组织出现脂肪和软。增生组织看起来相当大，但仍是脂肪和软。腺瘤，癌和侵袭性癌出现放大，僵硬和多模态到不同程度（图1）。
4. 在进行下一阶段之前，隔离每个肿瘤上的单个模块（推荐每个肿瘤2-3个）。
  注意：由于这种类型的肿瘤的多模态方面，必须特别注意，以便仅使用和分析单个模块。这是非常重要的，如果你想确保你是从特定阶段分离细胞，因为单个模块可能已经进展到不同的肿瘤阶段。模块的大小随着肿瘤大小，年龄，定位和各个小鼠之间而变化。推荐专家病理建议（见注2-3）。
5. 对于每个单个模块，取一部分用于组织病理学分析，一部分用于分离成纤维细胞。对于组织病理学分析，将样品在4℃下在10％NBF中固定过夜。参见图1，组织的代表性苏木精和曙红染色注意：这里不讨论组织病理学分析程序。请参阅其他协议。
6. 为了分离成纤维细胞，将样品的其余部分转移到10cm组织培养皿中，并使用手术刀和/或手术剪刀加工成较小的片。
  
  图1.来自MMTV-PyMT模型的来自正常FVB/n乳腺和进行性乳腺肿瘤阶段（增生，腺瘤和癌）的组织的代表性组织样品和苏木精和伊红染色。比例尺表示100μm。
处理正常乳腺组织样本
1. 对于正常乳房组织，将较小的组织片放置在盘中，在其中在20mm盖玻片下将其压缩以防止脂肪组织漂浮。
  注意：如果使用胶原酶/疏散方法（见下文）处理正常乳腺组织，则分离非常少量的成纤维细胞。
2. 然后缓慢加入新鲜的完全培养基DMEM以防止样品漂浮。
  注意：样品需要与塑料和盖玻片接触，以便成纤维细胞从样品中出来。
3. 每天用新鲜的完全培养基更换培养基7天。
  注意：7天后，成纤维细胞从组织中出来进入盖玻片和皿中，并且可以转移到新的皿中。
4. 去除原始组织。将盖片转移到新的皿（细胞面朝上的一侧）。
5. 将原始皿和具有盖玻片的皿用PBS洗涤一次，并使用胰蛋白酶/EDTA在37℃下胰蛋白酶化成纤维细胞10分钟。
6. 将细胞重悬浮并接种到新培养皿中。
  注意：细胞数目可以最小化扩展，总是考虑到原代细胞在体外延长培养后进入衰老。
7. 细胞现在准备永生化（从步骤E30开始）。
加工乳腺增生，腺瘤和癌组织样品
1. 对于增生，腺瘤和癌样品，将较小的组织片放置在盘中，在那里它们使用手术刀进一步分离。
  注意：或者，对于极度脂肪性增生样品，可以使用正常的组织分离方法（步骤C10-16）。
2. 将胶原酶/分散酶溶液（100mg/ml）在无菌PBS Mg 2 +缓冲液中稀释1:100，并在使用前用22μm过滤器过滤（终浓度1mg/ml）注意：胶原酶/分散溶液是一种组织分解溶液，其在不影响质膜完整性的情况下使胶原蛋白和网状纤维降解。
3. 将离析的组织置于具有适量胶原酶/分散酶的无菌管中。吸移上下数次以帮助分解。然后将样品在轨道摇床上在37℃和180rpm下孵育60分钟注意：一般每个样品使用2-3ml（250-500mg的组织）。调整样品大小。
4. 向每个样品中加入一体积的PBS 1mM EDTA。让它通过移液器几次。
  注意：EDTA停止蛋白酶反应，因为它是一种胶原酶抑制剂。
5. 使用3mm过滤器过滤样品。
  注意：此步骤可去除未消化的组织。也可以使用替代方法（橡胶注射器柱塞等）。
6. 将样品在室温（RT）下以100×g离心5分钟。
7. 丢弃上清液。含有细胞的沉淀用完全培养基洗涤并在100×g下再次在室温下离心5分钟。
8. 弃去上清液。含有细胞的细胞在室温下用完全培养基加DNA酶1（终浓度10μg/ml）温育10分钟。
  注意：通常由于细胞损伤，DNA泄漏到解离介质中，增加粘度并引起处理问题。纯化的DNase包括在细胞分离程序中以消化核酸而不损伤完整细胞。
9. 将样品在室温（RT）下以100×g离心5分钟。
10. 重复步骤D23两次。
11. 除去培养基，将细胞重悬于完全培养基中并接种在培养皿中。将样品放在培养箱中。
12. 30分钟后，所有样品中的培养基用新鲜的完全培养基替换并放回培养箱中注意：30分钟后，大多数成纤维细胞将粘附在培养皿上，而其他细胞类型将保持悬浮状态。使用此提示将帮助您丰富成纤维细胞群体。
13. 2-3天后，可以使用增强的对成纤维细胞塑料的粘附性来富集分离的细胞用于成纤维细胞群。
  1. 媒体已删除。
  2. 用PBS洗涤细胞一次
  3. 细胞用胰蛋白酶/EDTA覆盖并置于培养箱中10分钟。
  4. 将细胞重悬于完全培养基中，接种到新培养皿中并放回培养箱中30分钟
  5. 用新的新的完全培养基替换培养基。
永生化不同肿瘤阶段的原代成纤维细胞
1. 开始之前请阅读说明4-5。
2. 生长Phoenix-ECO细胞接种以在转染时达到80％汇合（参见注释6）。
  注意：Phoenix-Eco细胞用于产生亲嗜性病毒以感染小鼠成纤维细胞。为了使人成纤维细胞永生化，请使用替代方法（参见注释4和6）。强烈建议优化逆转录病毒的体积和滴定，但不在此讨论。还推荐使用易于点阳性对照（例如转染编码荧光蛋白的逆转录病毒质粒）。这允许快速评估您的感染效率（例如对荧光阳性细胞评分）。
3. 一旦它们达到80％汇合，使用磷酸钙方案转染Phoenix-Eco细胞。通常为10厘米板。
  1. 在转染前2小时用完全培养基更换培养基。
  2. 在管A中，混合pBabe-HPV-E6-嘌呤霉素（10μg），2M CaCl 2（67μl）和无核酸酶水（高达500μl）。
  3. 在管B中，加入500μl的2x Hepes
  4. 在鼓泡A中的内容物时，慢慢地向其中加入管B的内容物
  5. 在室温下放置30分钟。
  6. 将转染混合物滴加到Phoenix-Eco细胞中
4. 18小时后，为了爆发转录，将丁酸钠加入细胞（终浓度10mM）。
5. 4小时后，用新鲜的完全培养基替换培养基
6. 48-72小时后，收集含有病毒的培养基并通过0.45μm过滤器过滤。病毒可以等分并保存在-80℃直至使用。
  注意：所有使用的材料在处置前必须留在virkon中（见注5）。
7. 原代成纤维细胞用HPV-E6-嘌呤霉素逆转录病毒感染。
  1. 去除成纤维细胞培养物上的培养基
  2. 将含有病毒的培养基与完全新鲜培养基1:1混合，将所得溶液加入成纤维细胞中。
  3. 聚凝胺（终浓度2μg/ml）也加入到细胞中。
    注意：如果受体细胞悬浮（例如在胰蛋白酶消化后），感染效率可能增加。聚凝胺（溴化己二甲铵）是一种阳离子聚合物，用于提高某些细胞在细胞培养中用逆转录病毒感染的效率。
8. 5小时后，用新鲜培养基更换培养基注意：或者，可以在18小时后更换介质。
9. 24-48小时后，通过在完全培养基中加入嘌呤霉素（2μg/ml终浓度）选择感染的细胞。
  注意：根据细胞类型的不同，嘌呤霉素的可接受性不同。最终浓度需要在最终使用前进行优化。
10. 在7-10天后，表达HPV-E6（即永生化细胞系）的抗性克隆是可见的。克隆或池可以在冷冻培养物中扩增用于随后使用。
  注意：最终，必须进行分离和永生化群体的性质的表征。这可以通过通过免疫荧光，FACS等分析某些标志物的表达来进行。推荐的成纤维细胞标志物是CD140A/PDGFRA，CD90/Thy-1，波形蛋白和纤连蛋白。成纤维细胞对于免疫细胞标记（CD45阴性），内皮标记（CD31阴性）和上皮标记（E-钙粘着蛋白，EpCAM阴性）也应是阴性的。对于癌症相关的成纤维细胞标记，我们推荐αSMA，FAP和FSP1/S100A4。

笔记

这个程序工作异常好，因为它是针对这种肿瘤模型进行了优化。重要的是，MMTV-PyMT乳腺癌细胞不在组织培养塑料盘上生长。另一方面，成纤维细胞生长非常好。因此，只需将您的提取物在塑料中培养，即可富集成纤维细胞群，避免任何来自癌细胞的污染。然而，如果使用已建立的癌细胞系，则该方法不起作用，因为那些细胞适于在塑料中生长并且将最终超过成纤维细胞群体。为了防止这种情况，需要设计其他方法（FACS分选，在癌细胞中使用自杀基因，等）。
这个程序需要一个良好的特征模型，并很多熟悉其发展的不同肿瘤阶段。因此，重要的是，在其应用之前，研究人员熟悉它。专家病理评估至关重要。我们建议对不同年龄，大小，方面和部位的多种肿瘤的彻底病理分析。这将最终允许研究者自信地预测每个肿瘤的阶段。即使如此，必须始终对用于成纤维细胞分离的肿瘤的肿瘤阶段进行回顾性病理分析。
组织病理学和免疫细胞化学方法不会在本协议中讨论。根据类型，组织，小鼠应变等，肿瘤进展是高度可变的。为了表征每个肿瘤阶段，请咨询病理学家以获得关于最佳方法，技术和标记的建议以清楚地定义每个阶段。
原代细胞和特别地成纤维细胞可以在它们变得衰老之前在培养中维持几次传代。衰老诱导多种转录和功能变化，这可能深刻影响所研究的表型。因此，如果需要长期培养，永生化是必要的。理想地，应当比较初级和永生化培养物以检查永生化程序是否未诱导所研究的表型的任何变化。对于永生化小鼠成纤维细胞，我们表达人乳头瘤病毒"早期基因"E6，通过抑制p53活性防止复制衰老。因此，预期在特定功能和信号传导途径中的其它"脱靶"后果。对于受端粒长度（例如人类）影响最大的细胞，推荐一种替代方法。在这些情况下，细胞永生化可以通过端粒酶逆转录酶蛋白（hTERT）的表达来实现。这种蛋白质在大多数体细胞中是无活性的，但是当hTERT外源表达时，细胞能够保持足够的端粒长度以避免复制衰老。对几种端粒酶 - 永生化细胞系的分析已证实细胞维持稳定的基因型并保留关键的表型标记物。
永生化通过靶成纤维细胞的逆转录病毒感染来实现。因此，处理和处置病毒和受污染材料必须始终根据您的机构法规进行。
Phoenix-ECO最初在Garry P.Nolan实验室（美国斯坦福大学）建立，并且可在ATCC（Pear等人，1993）获得。它们是用于产生无辅助性的亲嗜性逆转录病毒的逆转录病毒生产线。该系基于293T细胞系（用腺病毒E1a转化并携带与新霉素共同选择的温度敏感性T抗原的人胚胎肾系）。该细胞系可用磷酸钙介导的转染或基于脂质的转染方案高度转染。通过将能够产生gag-pol的构建体和用于亲嗜性病毒的包膜蛋白置于293T细胞中产生该系。 Phoenix-Ampho是一种类似的细胞系，而不是产生双嗜性逆转录病毒

食谱

完整的介质（始终使用温暖37°C）
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）高葡萄糖与稳定的L-谷氨酰胺
1％胰岛素 - 转铁蛋白 - 硒溶液（ITS） 10％胎牛血清（FBS）
青霉素/链霉素

致谢

此协议是Calvo 等人（2013）中描述的扩展版本。 FC，SH和ES由Cancer Research UK grant CRUK_A5317支持。我们感谢实验室成员在整个工作中提供帮助和建议。

参考文献

Calvo，F.，Ege，N.，Grande-Garcia，A.，Hooper，S.，Jenkins，RP，Chaudhry，SI，Harrington，K.，Williamson，P.，Moeendarbary，E.，Charras， Sahai，E。（2013）。机械转导和YAP依赖性基质重塑是癌症相关成纤维细胞的产生和维持所必需的。/a> Nat Cell Biol 15（6）：637-646。
Guy，C.，Cardiff，R。和Muller，W。（1992）。通过多瘤病毒中间T癌基因表达诱导乳腺肿瘤：转移性疾病的转基因小鼠模型。 Mol Cellr Biol 12（3）：954-961。
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Pear，W.S.，Nolan，G.P.，Scott，M.L。和Baltimore，D。（1993）。通过瞬时转染产生高滴度无辅助病毒的逆转录病毒。 Proc Natl Acad Sci USA 90（18）：8392-8396。