材料和试剂

拟南芥种子IU.GUS-8和DGU.US-1（图1）（Orel等人，2003）的种子[渐渗入各种遗传背景和基因分型为报告基因的纯合性和突变（Rosa等人，2013）。例如，我们使用野生型Columbia-0和突变体 arp6-3 和 swc6-1 。这两种突变体缺乏SWR1复合体的拟南芥属同源物的亚基，并且除了对DNA损伤剂敏感外（Rosa等人，2013），具有多向性发育缺陷（更多信息参见Schuermann等人，2005）]
次氯酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：425044）
吐温-80（Sigma-Aldrich，目录号：4780）
无菌H 2 O 2/b
固体培养基
液体植物生长培养基（与固体生长培养基相同，但不含琼脂）
羟基脲
70％乙醇
种子灭菌溶液（见配方）
Bleocin（博来霉素的商品名）（EMD Millipore，目录号：203408）（参见Recipes）
丝裂霉素C（Duchefa Biochemie BV，目录号：M0133）（参见Recipes）
GUS染色溶液（参见配方）
1 M磷酸钠缓冲液（参见配方）

设备

用于植物培养的塑料培养皿（参见注释）（圆形200×15mm，具有20ml固体生长培养基）
无菌罩，优选生物安全柜，以避免暴露于基因毒素
台式块振动器（如 Eppendorf，Thermomixer ^®）
UV交联剂（254nm UV灯泡，每种15瓦）（Stratagene，型号：Stratalinker 2400）
镊子
箱或铝箔
parafilm
1.5 ml Eppendorf管
50和15ml Falcon管
真空应用器（如干燥器）
植物生长设施，在21℃下，16小时光/8小时黑暗循环
37℃的培养箱
立体显微镜

程序

在1.5ml Eppendorf管中用1ml灭菌溶液洗涤种子，在台式块振荡器中在室温下以300rpm振摇6分钟。使种子固定在Eppendorf的底部并除去上清液。用1ml无菌水洗涤5次，在振荡器中5分钟。最后一次洗涤后，取出上清液，在封闭的无菌罩中干燥过夜，留下管子开口注意：每个基因型和处理消毒约200粒种子。所有涉及种子或苗子操作的后续步骤应在无菌罩中进行。
使用火焰灭菌和冷却的镊子在具有生长培养基（每板约75至100个和每个基因型2个板并处理）的200×15mm培养皿上平板种子。在4℃下在黑暗中（在盒子中或包裹在铝箔中）分层2至4天，并用照明转移到生长室。
注意：任何其他无菌电镀技术都是适合的。
治疗
1. Bleocin和丝裂霉素C：生长植物直到第7天。加入10ml无药液体培养基或含有0.1μg/ml bleocin或10μg/ml丝裂霉素C的培养基。用石蜡膜密封并恢复正常生长条件直到分析。无需振动。
  注意：生长至第7天=转移到生长室后7天。
2. 羟基脲：在固体生长板上铺种子，没有或含有1mM的化学物质，并在标准条件下生长直到分析。
3. UV-C：生长幼苗直到生长的第4天，并在Stratalinker中用8kJ/m 2 UV-C处理。返回标准条件直到分析。
  注意：在治疗之前，用70％乙醇灭菌Stratalinker的内部，并且用最大剂量的UV-C运行3分钟。然后将板放在里面，取下盖子，保持它在Stratalinker内。快速关闭门，以避免污染，并运行所需剂量的UV-C。当治疗完成时，关闭板仍然在Stratalinker内，并恢复到正常的生长条件。
GUS组织化学测定法
1. 用镊子，仔细收集每个板的12天龄的植物在15毫升Falcon管中，并将其浸没在10毫升GUS染色溶液中。小心不要破坏根，子叶或叶子。真空浸润15分钟，并在37℃下孵育过夜
2. 在70％乙醇中将植物在37℃下脱色过夜。继续每天更换乙醇两次，直到大多数植物组织是白色的。
3. 在立体显微镜下，GUS阳性蓝色区段的数目表示每个整株植物的重组事件（图1B）。为了分析数据，生成具有不同数量的蓝色扇区的幼苗的频率的直方图，以及每行和处理中的总频率（图2）。
图1.测定原理。（A）SHR DGU.US-1和IU.GUS-8（改编自参考文献2）的报道系中的重组底物。这些系被设计为在内切核酸酶I-SceI表达后在DSB修复后区分不同的体细胞重组途径（单链退火和合成依赖性链退火）（Orel等人，2003;关于不同SHR途径的信息参见参考文献1）。然而，它们在这里用于测量不含I-SceI的SHR，但是在不同的外源DNA损伤处理后。 DGU.US-1底物含有GUS ORF的两个片段，其具有直接取向的同源部分（GU，US），具有557bp的重叠。在IU.GUS-8中，直接取向的GUS ORF（"GU"，"US";蓝色）的两个片段分开，使得基因不起作用。与"GU"和"US"部分同源并且含有"U"的1087bp的片段以反向方向位于上游。重复之间的SHR事件可以以不同的方式恢复功能基因（GUS）：在DGU.GUS-1系中，删除两个重复之间共同的序列，而IU.GUS-8中的间接重复之间的HR导致恢复GUS基因。 P：花椰菜花叶病毒的组成型35S启动子; T：胭脂碱合酶终止子; HPT：潮霉素抗性基因，BAR：膦丝菌素乙酰转移酶抗性基因，GUS：β-葡糖醛酸糖苷酶基因。（B）组织化学GUS染色允许观察其中GUS基因由SHR恢复的细胞（来自Orel等人，2003）。

图2. SHR频率测量的实例。在线IU.GUS-8中具有不同数目的蓝色扇区和总频率的幼苗的分布。（A）模拟物和（B）1μg/ml Bleocin处理。扇区/植物指在分析的幼苗群体中对应于重组事件的蓝色区段的平均数目。误差棒对应于SE。每个突变群体中的SHR频率与其野生型（WT）对应物显着不同， 0.001。星号表示根据来自未配对的试验的P值的处理的和模拟群体之间的显着性：*** P < 0.001和** 0.001 < P < 0.01。

笔记

对于所有处理，总是保持板属于一个实验（模拟+处理）并排生长。例如，将生长室中的模拟和UV-C处理板同时取出
在该实验中，我们使用参考文献6中描述的萌发培养基（GM）（详细方案可参见http://www.gmi.oeaw.ac.at/research-groups/ortrun-mittelsten-scheid/research-groups/ortrun-mittelsten -scheid/gm-medium-protocol）。我们没有测试过使用常规MS培养板，但没有理由相信培养基会成为决定性因素，只要每个实验中使用的培养板来自同一批培养基。

食谱

种子灭菌溶液
由5％次氯酸钠和0.05％Tween-80组成将500μl次氯酸钠和5μl吐温-80在10ml无菌H 2 O中混合
Bleocin（原液10mg/ml）
将100mg的Bleocin溶解在10ml H 2 O中使0.2毫升等分试样，并保持在-20°C，直到使用
避免解冻/冻结周期
在液体介质中稀释至所需浓度，使用一次性50ml falcon管
丝裂霉素C（原液0.5mg/ml）
在使用前立即将2mg丝裂霉素C溶于4ml H 2 O中
在液体介质中稀释至所需浓度，使用一次性50ml falcon管
GUS染色溶液
由1mM磷酸钠缓冲液（pH7）; 10mM EDTA，0.1％Triton-X，100mg/ml氯霉素; 2mM亚铁氰化钾; 2mM铁氰化钾; 0.5mg/ml X-葡萄糖醛酸苷混合：
10ml 1M磷酸钠缓冲溶液（pH7）（见下文）
4ml 0.25M EDTA溶液pH 8
0.5ml 20％（w/v）Triton X-100 0.2ml 50mg/ml氯霉素
1ml 0.2M铁氰化钾
1ml 0.2M亚铁氰化钾 2.5ml 20mg/ml X-Gluc（保存在-20℃的黑暗中）用MilliQ水加至100ml，过滤灭菌（0.2微米过滤器），并保持在4℃，包裹在铝箔中。如果在这些条件下储存，该溶液将稳定长达一个月
1M磷酸钠缓冲液（最终pH 7）
制备200ml 1M磷酸二氢钠（这是酸，约pH 4）放入烧杯中并逐渐加入到该1M磷酸二氢钠（pH约9）中，直到混合物在20℃下达到pH 7为止。
高压灭菌器

致谢

我们感谢Holger Puchta友好地提供重组底物系和GudrunBöhmdorfer有助于讨论DNA损伤剂。工作得到来自奥地利联邦科学和研究部的Grants GEN-AU GZ 200.140-VI/1/2006和来自奥地利科学基金的FWF P18986-B17的支持。该方案用于Rosa等人（2013）。 GUS组织化学测定最初由Pecinka等人建立。（2009）。

参考文献

March-Díaz，R。和Reyes，J.C。（2009）。作为一个变体的美丽：H2A。 Z和SWR1复合物。 Mol Plant 2（4）：565-577。
Masson，J。和Paszkowski，J。（1992）。拟南芥的培养物反应原生质体由供体植物的生长条件决定。植物J 2（5）：829-833。
Orel，N.，Kyryk，A。和Puchta，H。（2003）。同源重组的不同途径用于修复串联安排的序列中的双链断裂植物基因组。植物J 35（5）：604-612。
Rosa，M.，Von Harder，M.，Cigliano，R.A.，Schlogelhofer，P.and Mittelsten Scheid，O。（2013）。 A rabidopsis SWR1染色质重塑复合物对DNA修复很重要，体细胞重组和减数分裂。植物细胞 25（6）：1990-2001。
Pecinka，A.，Rosa，M.，Schikora，A.，Berlinger，M.，Hirt，H.，Luschnig，C.and Mittelsten Scheid，O。（2009）。跨代压力记忆不是拟南芥中的一般反应。 PLoS One 4（4）：e5202。
Schuermann，D.，Molinier，J.，Fritsch，O。和Hohn，B。（2005）。植物中同源重组的双重性质。趋势基因21（3）：172-181。

Waterworth，W.M.，Drury，G.E.，Bray，C.M.and West，C.E。（2011）。修复植物基因组中的缺口：保持它们的重要性。新手机 192（4）：805-822。