材料和试剂

感兴趣的细胞系（HepG2，HUH7，CMK，K562等）或原代细胞[例如：鼠骨髓衍生的树突细胞（BMDC）]
Cyto-ID 自噬检测试剂盒（Enzo Life Sciences，目录号：ENZ-51031-K200）
含有100U /100μg/ml青霉素/链霉素（Life Technologies，Gibco）的含有10％胎牛血清（FBS）（Biochrom，目录号：S0615）的Eagle's最小必需培养基（EMEM）（ATCC，目录号：30-2003） ^®，目录号：15140-122）
含有10％FBS和100U /100μg/ml青霉素/链霉素的含有L-谷氨酰胺的RPMI 1640（Lonza，目录号：BE12-702F）
DMEM（低葡萄糖，丙酮酸盐，无谷氨酰胺，无酚红）（Life Technologies，Gibco ，目录号：11880-028）
Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水（DPBS）（Biochrom，目录号：L1825）
1x 0.05％胰蛋白酶-EDTA（酚红）（Life Technologies，目录号：25300）
含有6mM葡萄糖（饥饿培养基）的Hanks平衡盐溶液（HBSS）（Life Technologies，Gibco ，目录号：14025）
来自吸湿链霉菌（1-5μmol/L）（Sigma-Aldrich，目录号：R0395）的雷帕霉素
PP242水合物（1-5μmol/L）（Sigma-Aldrich，目录号：P0037）
3-甲基腺嘌呤（3-MA）（3-10mmol/L）（Sigma-Aldrich，目录号：M9281）
渥曼青霉素（30-100nmol/L）（Sigma-Aldrich，目录号：W3144）
LY294002（7-20μmol/L）（Sigma-Aldrich，目录号：L9908）
诺可达唑（12-50μmol/L）（Sigma-Aldrich，目录号：M1404）
长春花碱（12-50μmol/L）（Sigma-Aldrich，目录号：V1377）
氯化铵（NH 4 Cl）（10-20mmol/L）（Sigma-Aldrich，目录号：A0171）
硫酸氢氯喹（HCQ）（5-10μmol/L）（Sigma-Aldrich，目录号：H0915）
氯喹（CQ）（5-10μmol/L）（Sigma-Aldrich，目录号：C6628）
二甲基亚砜DMSO（Sigma-Aldrich，目录号：D8418）

设备

37℃，5％CO 2湿润培养箱
离心机
FACSCalibur，LSR II（BD）或类似设备

程序

维持细胞在标准组织培养条件下在37℃，5％CO 2在湿润的培养箱中。保持细胞密度低于1×10 6 /μL/ml。
注意：在分析之前，细胞应在新鲜培养基中保持几小时（最少12小时），以避免由于营养物耗尽而导致潜在的自噬激活。一般培养基包含自噬影响物质：氨基酸，葡萄糖，生长因子，激素等。在比较不同条件下的自噬通量时要注意所有必要因素的正常化。在分析不同物质对自噬的影响时，例如DMSO，乙醇等，也可以影响自动通量。
在所需的时间和在感兴趣的条件下孵育细胞。应包括经过载体处理的阴性对照。
注意：当分析延长的时间段和/或潜在地影响细胞数量或存活力的条件下时，营养物消耗和因此丰度的差异可能发生，并且影响自我结果，因为自噬活性与营养状态高度相关。
阳性对照[雷帕霉素（1-5μmol/L），PP242（1-5μmol/L），含6mmol/L葡萄糖的Hanks平衡盐溶液（饥饿培养基）]和阴性对照[3-甲基腺嘌呤），枸杞素（30-100nmol/L），LY294002（7-20μmol/L），诺考达唑（12-50μmol/L），长春花碱还可以包括氯化铵（NH 4 Cl）（10-20mmol/L），氢氯喹（HCQ）或氯喹（CQ）（5-10μmol/L）]。
治疗期结束后，用DPBS清洗细胞。对于悬浮细胞使用离心，对于粘附细胞，因为它们是粘附的（不胰蛋白酶消化），所以洗涤
重悬悬浮细胞，或添加到贴壁细胞Cyto-ID Green含有指示剂的细胞培养基，含有5％FBS。染色阶段的建议细胞密度为10 5至10 6个细胞/ml。建议的Cyto-ID绿色浓度是1ml Cyto-ID绿色检测试剂在1ml细胞培养基中。
充分混合并在标准组织培养条件下在37℃，5％CO 2在黑暗中孵育30分钟。
在染色程序结束时，洗去含Cyto-ID的培养基。再次用DPBS洗涤并重悬浮悬浮细胞或胰蛋白酶消化，洗涤并将贴壁细胞悬浮在含有2％FBS的冰冷的DPBS中。
注意：在染色步骤完成后注意，尽可能保持在冰上和在黑暗中。
使用流式细胞仪分析样品和细胞计数的绘图数据作为FITC（FL1）荧光强度。表1可用于方便解释结果。

表1.未知物质X的分析

X plus
中
激活

I
→
↑↑

II
↑↑
↑↑↑

III
↓↓
↓或↑

注意：
1. →↑↓：ΔMFICyto-ID = MFI Cyto-ID（+ CQ/NH （-CQ/NH ₄ Cl）。 CQ/NH4Cl留在CQ或NH4Cl。
  警告：ΔMFICyto-ID的计算需要+ CQ/NH 4 Cl和-CQ/NH
2. 建议与氯化铵（NH 4 Cl）（10-20mmol/L）或氯喹（CQ）（5- 10μmol/L）为5小时。
3. （活化剂）：自噬诱导[雷帕霉素（1-5μmol/L），PP242（1-5μmol/L）或饥饿培养基]。建议温育5 h。（注意：应针对特定细胞类型确定活化剂的浓度。）
4. 未知物质X的分析应包括与一种或多种激活剂的共孵育。表1示出了三种可能的情况。 a）情况（I）未知物质X不影响细胞自噬活性; b）情况（II）X是活化剂; c）情况（III）X是自噬的抑制剂。
5. 注意：虽然被认为是用于分析自溶通量的最准确的灵敏和可靠的方法，但是Cyto-ID染色细胞的流式细胞术测定应当与具有非重叠限制的替代方法组合，例如电子显微镜（EM）荧光显微镜（FM ），western印迹（WB）等。
6. 示例数据：
  
  图1.在自噬抑制剂3MA（10mM）与自噬激活物PP242存在或不存在的情况下在最后5小时（左）中与自噬抑制剂3MA（10mM）孵育的BMDC中的自噬通量的流式细胞术分析，/strong>

致谢

Stankov，M和Behrens，G由DFG（BE-2089/2-1和EXC62/1）支持。 Klusmann，J获得了Wilhelm Sander-Foundation（2011.057.1），德国研究基金会（DFG; KL-2374/1-1）的资助。 Klusmann，J是DFG（KL-2374/2-1）的Emmy Noether程序的研究员。 Leverkus，M由DFG（LE-953/8-1和LE-953/6-1）和Mildred-Scheel-Stiftung（＃109891）。

参考文献

Cyto-ID ^®自噬检测试剂盒手册（Enzo Life Sciences）。 http://www.enzolifesciences.com/fileadmin/enzo/Manuals/51031 -K200.pdf。
Mizushima，N.，Yoshimori，T。和Levine，B。（2010）。哺乳动物自噬研究中的方法。细胞 140（3 ）：313-326。
Sinicrope，F.A.，Sirko，A.，Siu，P.M.et al。（2012）。监测自噬的测定法的使用和解释指南。 Autophagy 8（4）：445-544。
Stankov，MV，El Khatib，M.，Kumar Thakur，B.，Heitmann，K.，Panayotova-Dimitrova，D.，Schoening，J.，Bourquin，JP，Schweitzer，N.，Leverkus，M.，Welte，K 。，Reinhardt，D.，Li，Z.，Orkin，SH，Behrens，GM和Klusmann，JH（2014）。组蛋白脱乙酰酶抑制剂通过抑制自噬而诱导骨髓性白血病的凋亡。白血病 28（3）：577-588。