材料和试剂

贴壁细胞（例如A549，Hela，SAOS）（在小圆形盖玻片上，生长至亚汇合）
冰块
馏分V（Sigma-Aldrich，目录号：850-40℃）
（在含有1％血清的培养基中稀释;使用：4-5μg/ml）的第一抗体（结合α2-整合素胞外域）（例如AbD Serotec，目录号：MCA2025）
识别一级抗体（例如：山羊抗小鼠Alexa-488和555; Life Technologies，目录号：A-11001和A-21424）（在含有1％血清的培养基中稀释;使用：1.3μg/ml ）
血清（Life Technologies，目录号：10270-106）
DAPI延长金色固定介质（Life Technologies，目录号：P36935）或任何其他固定介质
磷酸盐缓冲盐水（PBS）
含0-10％血清的培养基（参见配方）
4％多聚甲醛（PFA）（Sigma-Aldrich，目录号：P-6148）（参见配方）

设备

Coverslip（Thermo Fisher Scientific，Menzel-Gläzer）
CO <2>孵化器
共聚焦荧光显微镜

软件

BioImage XD的数据分析（开源， http://www.bioimagexd.net/）
ImageJ

程序

在实验前一或两天将合适的贴壁细胞（例如A549或Hela细胞）在圆盖玻片上培养：将无菌盖玻片置于合适的细胞培养皿上，并将细胞铺在其上。在实验之前，您可以将贴壁细胞的盖玻片转移到合适的支架上，例如4孔，6孔或12孔平板。
在冰上冷却细胞几分钟（以抑制内吞作用/α2β1整联蛋白吸收）。
弃去培养基并加入一抗：30μl/盖玻片，在冰上60分钟
轻轻地洗涤未结合的抗体，小心地将BSA-PBS加入细胞，不引起脱离（每次5x白蛋白的3x冰冷PBS）。对于白蛋白，第V部分适用
二抗（Alexa 555）孵育：30μl/盖玻片，在冰上30分钟（在黑暗中保持盖玻片覆盖）。
洗涤未结合的抗体（3x BSA-PBS，在冰上）
α2β1-整联蛋白内化：在细胞上加入培养基（含10％血清），并在37℃在CO 2培养箱中孵育细胞优选的时间（实施例2h）。
标记未内化的/细胞表面相关的α2β1整联蛋白：冷却冰上的细胞，并按照步骤4进行第二抗体温育，但现在使用不同的荧光标签（例如Alexa 488）。
洗涤未结合的抗体（3x BSA-PBS）
在室温下用4％PFA固定细胞20分钟
用DAPI延长金（或任何其他安装介质）安装细胞。
1. 当你成像的细胞，你会有你的内化的α2β1整合素在"红色"（标记与Alexa 555共轭次级）和细胞表面相关的α2β1整合素在"绿色/黄色"（标记与Alexas 555和488）。
2. 可以通过比较总α2β1整联蛋白池（Alexa 555和488共定位）和细胞内α2β1整联蛋白（Alexa 555）的强度来分析细胞内α2β1整联蛋白的比率。
3. 强度分析可以例如使用ImageJ或BioImage XD进行。
4. 此外，BioImageXD包含一个简单的算法，用于计算表面/内化抗原的比率。公式是Ch1 /（Ch2-Coloc），其中Ch1是与细胞表面相关的体素的数目，Ch2是抗原的总池（细胞表面和细胞内），Coloc是共定位体素的数目。

食谱

含0-10％血清的培养基
1. 可以使用任何正常细胞培养基。 1％血清应包括在结合步骤中。
2. 完全细胞培养基（含10％血清）可用于内化步骤
4％PFA的配方
将4g多聚甲醛粉末溶解于40ml热水中，然后滴加1M NaOH直至溶液澄清，冷却溶液，加入50ml 0.2M磷酸盐缓冲液并将pH调节至7.4。

致谢

该方法是Karjalainen等人（2008）中描述的方案的修改。这项工作得到了芬兰学院的资助。

参考文献

精确协议的参考

Karjalainen，M.，Kakkonen，E.，Upla，P.，Paloranta，H.，Kankaanpää，P.，Liberali，P.，Renkema，GH，Hyypiä，T.，Heino，J.andMarjomäki，）。 A 筏衍生的Pak1调节的条目参与α2β1整联蛋白依赖性排序到caveosomes。 Mol Biol Cell 19（7）：2857-2869。

从协议修改的引用

Liberali，P.，Kakkonen，E.，Turacchio，G.，Valente，C.，Spaar，A.，Perinetti，G.，Böckmann，RA，Corda，D.，Colanzi，A.，Marjomaki，，A。（2008）。 Pak1依赖性大染色体的闭合需要CtBP1/BARS的磷酸化。 EMBO J 27（7）：970-981。
Rintanen，N.，Karjalainen，M.，Alanko，J.，Paavolainen，L.，Mäki，A.，Nissinen，L.，Lehkonen，M.，Kallio，K.，Cheng，RH，Upla，P.，Ivaska ，J。和Marjomäki，V。（2012）。钙蛋白酶促进非循环整合素途径中的α2β1整合蛋白转换。 Mol Biol Cell 23（3）：448-463。
Siljamäki，E.，Rintanen，N.，Kirsi，M.，Upla，P.，Wang，W.，Karjalainen，M.，Ikonen，E。和Marjomäki，胆固醇依赖的胶原和艾柯病毒1贩运沿着小说alpha2beta1整合素内化途径。 em> PLoS One 8（2）：e55465。
Turkki，P.，Makkonen，K.E.，Huttunen，M.，Laakkonen，J.P.，Ylä-Herttuala，S.，Airenne，K.J.andMarjomäki，细胞对杆状病毒转导和艾柯病毒感染的易感性被蛋白激酶C磷酸化和波形蛋白组织修饰。 J Virol 87（17）：9822-9835。