材料和试剂

新生小鼠（出生后一天的年龄）
目前的培养方法可以应用于任何小鼠品系，而不论性别。我们使用朊病毒蛋白过表达转基因小鼠和朊病毒蛋白缺陷小鼠为我们目前的研究（Iwamaru等人，2013年）。
不含Ca和Mg的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（D-PBS）（Nacalai Tesque，目录号：14249-95）
二钠乙二胺四乙酸二钠二水合物（EDTA）（Nacalai Tesque，目录号：151-11）
Hank's平衡盐溶液（HBSS）（Sigma-Aldrich，目录号：H8264）
Dulbecco's改良Eagle培养基/营养混合物F-12 Ham（DMEM/F12 Ham）（Sigma-Aldrich，目录号：D8437）
N-2补充剂（Life Technologies，目录号：17502-048）
青霉素 - 链霉素（Sigma-Aldrich，目录号：P0781）
胎牛血清（FBS）（Hyclone，目录号：SH30070.03）
Accutase（Innovative Cell Technologies，目录号：AT104）
胰蛋白酶（Sigma-Aldrich，目录号：T8003）（参见Recipes）
脱氧核糖核酸酶I（DNase I）（Worthington Biochemical Corporation，目录号：LS002139）（参见Recipes）
表皮生长因子人（EGF）（Sigma-Aldrich，目录号：E9644）（参见Recipes）
成纤维细胞生长因子 - 碱性人（bFGF）（Sigma-Aldrich，目录号：F0291）（参见配方）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A9576）（参见Recipes）
神经球基础培养基（见配方）

设备

Falcon 15ml锥形离心管（Corning，目录号：352096）
表皮生长因子人（EGF）（Sigma-Aldrich，目录号：E9644）（参见Recipes）
成纤维细胞生长因子 - 碱性人（bFGF）（Sigma-Aldrich，目录号：F0291）（参见配方）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A9576）（参见Recipes）
神经球基础培养基（见配方）

设备

Falcon 15ml锥形离心管（Corning，目录号：352096）...
Centrifuge (KUBOTA, model: 5220)
CO₂ incubator (set at 37 °C and 5% CO₂-95% air)
Reciprocal shaker (TAITEC, model: NR-1)
Laminar flow hood (W800 x H1050 x D500 mm) (Panasonic Corporation, SANYO, model: MCV-710ATS)
Scissors (NAPOX B-5H, 154 mm; NAPOX B-1112H, 110 mm), fine forceps (NAPOX A-5, 110 mm; NAPOX MA-45, 110 mm), spatula (Laboran 9-891-03, 180 mm)
Ice bucket

Procedure

Dissect the brain from newborn mice under Laminar flow hood (Figure 1). Spray 70% ethanol upon newborn mice and cut the head (Figure 2A). Make small incisions (Figure 2B, arrows) and remove the skin. Then, carefully remove the skull with forceps and expose the brain (Figure 2C).

Figure 1. Dissecting equipments arranged in a Laminar flow hood

Figure 2. Dissection procedures to obtain neonatal mouse brain
Scoop the brain by a small spatula and place them in ice cold HBSS (10 ml in 100 mm dish, Figure 3A). By using fine forceps, remove meninges under dissecting microscope (Figure 3B-C).

图3.在解剖显微镜下从新生小鼠脑中取出脑膜（B：箭头）。去除脑膜后，大脑变成发白的颜色（C）。
将皮质置于无菌的一次性微型匀浆器中，在4℃下以5000×g离心30秒。
用2ml含有1mM EDTA，100μg/ml胰蛋白酶和400μg/ml DNA酶I的D-PBS吸取切碎的组织，直至均匀匀浆，并将其放置在15ml锥形离心管中。
在37℃下在恒温搅拌器中使用往复振荡器在50rpm下孵育15分钟。加入1毫升的FBS，然后轻轻地吸上下来帮助解离通过使用气溶胶抗性尖端，以避免污染。在25℃下放置管2分钟，通过移液收集上清液。避免吸入任何可见的组织碎片。
在25℃下以200×g离心细胞悬浮液5分钟，并通过移液将沉淀物重悬于Neurosphere基础培养基（10ml）中。
在25℃下以200×g离心细胞悬浮液5分钟。弃去上清液，在25℃下重悬在5ml Neurosphere基础培养基中，并将其转移到具有HydroCell表面的Nunc 60mm培养皿中。在37℃在潮湿的CO 2培养箱（5％CO 2 -95％空气）中培养细胞。
每天补充0.5ml Neurosphere基础培养基。
5-7天后，在培养物中形成具有可变尺寸（直径50-100μm）的神经球（图4）。在25℃下以200×g离心神经球悬浮液5分钟，弃去上清液，并在37℃下在2ml Accutase中重悬浮10分钟。

图4.培养5天后在Neurosphere基础培养基中形成神经球。比例尺=100μmμm
轻轻吸上下（约10次）使用气溶胶抗性尖端分离成单个细胞。检查细胞在显微镜下成功解离。加入12ml HBSS并在25℃下以200×g离心5分钟。在25℃下将沉淀物重悬在10ml Neurosphere基础培养基中，并以1:4分流比（即，25％的收获细胞）接种到具有HydroCell表面的新的Nunc 60mm培养皿中盘具有相同的大小）。每天补充0.5毫升Neurosphere基础培养基。神经球以4-6天的间隔进行传代培养

食谱

脱氧核糖核酸酶I（DNase I）
以4mg/ml溶于D-PBS中
无菌过滤（0.22μm）
分装（4ml）并贮存在-20℃下在6个月内使用
表皮生长因子人（EGF）
以50μg/ml溶于含有1％BSA的无菌DMEM/F12 Ham中溶解分装（100μl）并贮存在-20℃下在6个月内使用
成纤维细胞生长因子 - 碱性人（bFGF）
以50μg/ml溶于含有1％BSA的无菌DMEM/F12 Ham中溶解分装（50μl）并储存在-20℃下
在6个月内使用
牛血清白蛋白（BSA）
以300mg/ml溶于D-PBS中
无菌过滤（0.22μm）
储存在4°C
在6个月内使用

神经球基础培养基

试剂	卷	最终浓度。
DMEM/F12 Ham	487.33 ml
EGF	500微升	50 ng/ml
bFGF	500微升	50 ng/ml
BSA	1.67ml ml	0.1％
N2补助	5 ml	1％
青霉素 - 链霉素	5 ml	100 IU/ml和100μg/ml，分别为

胰蛋白酶
在含有10mM EDTA的D-PBS中以1mg/ml溶解无菌过滤（0.22μm）
分装（4ml）并贮存在-20℃下在6个月内使用
对于切碎的脑组织的解离，混合试剂如下：

试剂
卷
最终浓度。

胰蛋白酶
1 ml
100μg/ml

DNase I
1 ml
400μg/ml

D-PBS
8 ml

致谢

这个协议改编自我们以前发表的文章： Iwamaru （2013）。这项工作得到了日本农业，林业和渔业部BSE和其他朊病毒病防治项目的资助，以及来自该部的青年科学家资助（B类）日本教育，文化，体育，科学和技术。

参考文献

Gage，F.H。（2000）。哺乳动物神经干细胞 Science 287（5457）：1433-1438。
Iwamaru，Y.，Takenouchi，T.，Imamura，M.，Shimizu，Y.，Miyazawa，K.，Mohri，S.，Yokoyama，T.and Kitani，H。 Prion复制引起分化的神经球培养物中的细胞病变。 em> 87（15）：8745-8755。