材料和试剂

病毒上清液（以前滴定）
XL-1蓝色感受态细菌细胞（Stratagene，目录号：200249）
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）（Sigma-Aldrich，目录号：D5523）
胎牛血清（Sigma-Aldrich，目录号：F7524）
Vero细胞（ATCC，目录号：CCL-81 ^TM）
肺泡猪巨噬细胞（Carrascosa et al。，1982）
猪血清（在巨噬细胞纯化期间获得）
Kapa HiFi聚合酶（Kapa Biosystems，目录号：KK2101）注意：此聚合酶试剂盒包括缓冲液和dNTPs。
引物B646L正向（Sigma-Aldrich）
5'ATGGCATCAGGAGGAGCTTTTTGTCTTATT
引物B646L反向（Sigma-Aldrich）
5'TTAGGTACTGTAACGCAGCACAGCTGAACCG
CloneJet PCR克隆试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：K1231）注意：该试剂盒包括pJET质粒，DNA连接酶和反应缓冲液。
用于DNA电泳的琼脂糖（Lonza，SeaKem LE agarose，目录号：50000）
TAE缓冲液（Sambrook和Russell，2001）
TE缓冲液（pH8.0）（Sambrook和Russell，2001）
5×琼脂糖凝胶负载染料（QIAGEN，目录号：239901）
QIAquick凝胶提取试剂盒（QIAGEN，目录号：28704）
LB-琼脂平板（Sambrook和Russell，2001）
氨苄青霉素（Sigma-Aldrich，目录号：A0166）
双蒸馏水或Milli-Q水

设备

软件

程序

样品制备

在多孔24孔板中在DMEM-10％胎牛或猪血清中培养约30,000细胞/cm 2的板Vero细胞和60,000细胞/cm 2的猪巨噬细胞，分别。在37℃，7.5％CO 2的细胞培养箱中放置过夜注意：有关ASFV感染协议的详细信息，请参阅参考文献4。
第二天以moi = 5pfu /细胞感染培养物
准备阴性对照的未感染细胞和额外的井，以监测通过滴定感染成功。在ASFV的情况下，我们像参考文献4中那样滴定病毒。可以使用其他方法来评估病毒复制，例如qPCR。
在感染后20小时，当达到总细胞病变效应时，在1.5ml Eppendorf管中收获细胞和培养基。
在Hettich（4℃）中以14,000rpm（约20,000×g）离心30分钟。
用冰冷的TE（约200μl）洗涤沉淀，再次旋转5分钟
将沉淀悬浮在50μl双蒸水中，在95℃的水浴中煮沸20分钟。
简单旋转，并使用上清液作为样品

准备PCR管

设置PCR程序

根据使用的引物对调整退火温度。可能需要增加熔化温度以避免非特异性扩增产物。此外，如果没有或非常少量的扩增产物，在较低熔解温度下用2-5个循环的额外PCR步骤可以改善结果。

变性温度和温育时间根据Kapa HiFi聚合酶推荐进行优化。

在琼脂糖DNA电泳中运行一小份等分试样（2μl）以验证和定量扩增产物
在0.7％高品质琼脂糖中运行PCR产物，在1x TAE缓冲液中运行凝胶。使用QIAquick凝胶提取试剂盒通过单带凝胶提取纯化PCR产物（此步骤可以避免，但克隆效率可能会降低）。

连接
使用约100ng的PCR产物和0.5-1μlpJET质粒。 CloneJet试剂盒包括2x反应缓冲液和T4DNA连接酶，尽管可以使用任何连接酶。制造商的说明书建议在室温下孵育5-30分钟，但可以进行更长的反应（长达2小时）以增加连接产量。
细菌转化
1. 用连接的质粒转化XL-1细胞，并在具有100μg/ml氨苄青霉素的LB-琼脂平板中平板。
2. 在37℃下孵育12-16小时后，挑选菌落并将其悬浮于5μlTE中以进行直接测序[如Sambrook和Russell（2001）中所述进行]。取每个样品至少15个菌落。
  可选：虽然理想情况下克隆效率为约80％，但是可以产生不从单条带纯化的PCR片段的假阳性。在这些情况下，强烈推荐接种5-10ml LB培养基以用于质粒的小量制备纯化，并通过限制性消化（质粒含有连接位点周围的BglII位点）检查插入片段的存在。
数据分析
可以手工检查或用不同的生物信息学软件装配序列。我们建议Geneious或CLC Genomics Workbench，它们允许同时显示比对和所有测序峰，以区分"混合峰"与真正的碱基变化。
实施例[参见Carrascosa et al。（1982）]：我们在56202个测序核苷酸中发现了3个TA-CG转换，其导致突变为5.34×10 -5 s -1 的频率。突变的数量通常较低，并且应该用非参数检验进行统计分析，如Mann-Whitney U，其在许多不同的软件包中实现，包括MS Excel，Prism Graph Pad或SPSS。

致谢

该协议基于Redrejo-Rodríguez等人（2013）中描述的程序。这项工作得到了西班牙经济部长竞争力奖（AGL2010-22229-C03-02）和拉美区域基金会的资助。

参考文献

Carrascosa，A.L.，Santaren，J.F.and Vinuela，E。（1982）。在猪肺泡巨噬细胞中产生和滴定非洲猪瘟病毒。病毒学方法 3（6）：303-310
de Leon，P.，Bustos，M.J。和Carrascosa，A.L。（2013）。研究非洲猪瘟病毒的实验室方法病毒研究 173（1）：168-179。
Nelson，JR，Cai，YC，Giesler，TL，Farchaus，JW，Sundaram，ST，Ortiz-Rivera，M.，Hosta，LP，Hewitt，PL，Mamone，JA，Palaniappan，C.and Fuller，。 TempliPhi，phi29基于DNA聚合酶的滚环扩增用于DNA测序的模板。 Biotechniques Suppl ：44-47
Redrejo-Rodriguez，M.，Rodriguez，J. M.，Suarez，C.，Salas，J.and Salas，M.L。（2013）。涉及非洲猪瘟病毒的修复性DNA聚合酶Pol X维持病毒基因组稳定性< em> J Virol 87（17）：9780-9787。
Sambrook，J。和Russell，D。（2001）。分子克隆：实验室手册，4版冷泉港实验室出版社。