材料和试剂

细胞系（即 HEK-293细胞）
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）（Sigma-Aldrich）
丙酮酸钠
L-谷氨酰胺
抗生素：链霉素和青霉素
胎牛血清
TransFectin ^TM脂质试剂（Bio-Rad Laboratories）
汉克平衡盐溶液（HBSS）（参见配方）
细胞培养基（参见配方）

设备

18毫米直径的玻璃盖片
Attofluor支架
配备63x油浸物镜的倒置Axio观察显微镜（ZEISS）
彩色V（TILL Photonics）
雪崩光电二极管（TILL Photonics）
局部药物应用系统（ALA Scientific Instruments，OCTAFLOW ^TM）
Digidata 1440A模拟/数字转换器（Molecular Devices）

软件

pCLAMP（Molecular Devices）
GraphPad Prism（GraphPad软件）

程序

在实验前两天，将细胞（即HEK-293细胞）接种在18mm直径的玻璃盖玻片上，并用标记有CFP的A 2A 2A R构建体瞬时转染在其N-末端尾（A 2A 2A R CFP ）（图1）。

图1. A _2A R ^{CFP 构建。将HEK-293细胞瞬时转染A 2A sub R CFP ，固定并通过共聚焦显微镜分析。 A/2A/R/sup> CFP}主要靶向细胞表面，并且在细胞内水平几乎不积累（Fernández-Dueñas等人，2013）。比例尺：10μm
实验当天，将瞬时转染的细胞安装在Attofluor保持器中，并置于装备有63x油浸物镜和双发射光度测定系统的倒置Axio Observer显微镜上。
然后，用FRET相容性A 2A 2A R荧光配体（即EMS MRS5424）连续超表达细胞（Fernández-Dueñaset al。，2012））溶解在HBSS中并且在局部药物施用系统的辅助下施用。
在我们的双发射测光系统中使用多色V作为光源。在用相应的施主激发波长（即A 2A 2A R CFP ）激发时，供体和受体荧光团的荧光信号通过雪崩光电二极管并使用Digidata 1440A模拟/数字转换器进行数字化。
pCLAMP和GraphPad Prism软件用于数据收集和分析。
因此，在430±10nm处的供体（即 A R ^CFP）激发下测量FRET信号[分束器二向色长通（DCLP）460nm]，并且照明时间在10Hz设置为10ms。然后，在535±15nm（F <535; MRS5424发射）和480±20nm（F <480> A <2A>）的条件下测定发射光强度，使用505nm的分束器DCLP。没有对通道之间的溢出或直接MRS5424激发进行校正。
将FRET比率（F 535/F 480）的增加拟合到等式：r（t）= A×（1-e ^{-t /τ}），其中τ是时间常数（以秒为单位），A是FRET信号的幅度（图2）。当需要计算τ时，减去由于光漂白引起的FRET中激动剂无关的变化（Fernández-Dueñas等人，2012，Fernández-Dueñas等人，2013）。

图2.FRET比率拟合的实施例。在A细胞转染的单个细胞中，A R ^CFP和MRS5424荧光发射信号的时间分辨的变化（参见图1）。记录响应于MRS5424应用的MRS5424（F 535）和CFP（F ））的发射强度与单个HEK293细胞的比率（蓝色曲线）（参见图1）。显示了用2μMMRS5424通过快速表面灌流诱导的变化。比率F 535/F 480的增加通过简单的单指数曲线拟合（r（t）= A×（1-e ^{-t /τ}）），使用GraphPad Prism软件，其在本实验中给出14±1秒的时间常数（τ）。该测定法非常适合于使用非荧光化合物的竞争性配体结合实验（Fernández-Dueñaset al。，2012，Fernández-Dueñaset al。，2013）。< br />

食谱

HBSS
137 mM NaCl 5.4 mM KCl
0.3mM Na 2 HPO 4
0.4mM KH 2 PO 4 sub/
4.2mM NaHCO 3 3/v/v 1.3mM CaCl 2 0.5mM MgCl 2 sub 0.6mM MgSO 4 5.6mM葡萄糖 pH 7.4
细胞培养基
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM），补充有：
1mM丙酮酸钠 2mM L-谷氨酰胺 100U/ml链霉素 100mg/ml青霉素
5％（v/v）胎牛血清

致谢

这项工作得到了来自加拿大研究和高等研究机构（FC）的经济部长奖学金SAF2011-24779，Consolider-Ingenio CSD2008-00005和PCIN-2013-019-C03-03以及加泰罗尼亚研究与高等研究学院ICREA学术成员2010 ，由国家糖尿病和消化和肾脏疾病研究所（NIDDK）校内研究计划（KAJ）。 FC属于"神经药理学和疼痛"认证研究组（Generalitat de Catalunya，2014 SGR 1251）。我们感谢巴塞罗那大学Bellvitge校区科学技术服务（SCT）小组的E.Castaño和B.Torrejón的技术援助。

参考文献

Fernandez-Duenas，V.，Gomez-Soler，M.，Jacobson，K.A.，Kumar，S.T.，Fuxe，K.，Borroto-Escuela，D.O.和Ciruela，F。（2012）。 A _2A RD ₂的分子决定因素 R变构性：D 2 r R的细胞内环3的作用。神经化学123（3）：373-384。
Fernández-Dueñas，V.，Gómez-Soler，M.，Morato，X.，Núñez，F.，Das，A.，Kumar，T. S.，Jaumà，S.，Jacobson，K.A。和Ciruela，多巴胺D 2受体介导的腺苷A 2A的调节受体激动剂结合在A 2A R/D 2 R寡聚体框架内。神经化学杂志63（1）：42-46。