材料和试剂

小鼠胚胎成纤维细胞（从第14.5天胚胎制备）
载体pGL4.14（ Luc2 编码载体）（Promega Corporation，目录号：E6691）
引物（Invitrogen定制DNA引物）
1. 5'-TAATACGACTCACTATAG GCCACCATGGAAGATGCCAAAAA-3'（T7 III类启动子序列加下划线。）
2. 5'-TACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTT-3'
rTaq DNA聚合酶（TOYOBO，目录号：TAP-211）
琼脂糖凝胶
溴化乙锭
Illustra GFX PCR和凝胶带纯化试剂盒（GE，目录号：28-9034-71）
MEGAScript体外转录试剂盒（Life Technologies，Ambion ，目录号：AM1333）
注意：试剂盒中包含无核酸酶的水和LiCl沉淀溶液。
80％乙醇
ScriptCap m7G加盖系统（epicenter，目录号：SCCE0610）
ScriptCap 2'-O-甲基转移酶试剂盒（震中，目录号：SCMT0610）
RNeasy迷你包（QIAGEN，目录号：74104）
Opti-MEM I还原血清培养基（Life Technologies，Gibco ，目录号：31985-070）
D-PBS（ - ）（Nacalai Tesque，目录号：14249-95）
Lipofectamine 2000DNA转染试剂（Life Technologies，目录号：11668-019）
双荧光素酶报告基因测定系统（Promega Corporation，目录号：E1960）
BCA蛋白测定试剂（Thermo Fisher Scientific，目录号：23227）

设备

细胞刮刀
GeneAmp PCR系统9700（Applied Biosystems ）
离心式浓缩器CC105（TOMY）
Lumat LB 9507发光计（Berthold Technologies）
Model 680微孔板读数器（Bio-Rad Laboratories）

程序

亚克隆Luc2 cDNA
1. 准备聚合酶链反应混合物。
  在冰上混合以下组分：
  0.2μlrTaq DNA聚合酶
  5μl用于rTaq的10x缓冲液（+ Mg）
  5μldNTP（每种2mM）
  4μl引物（每种正向和反向引物各10mM）
  1μl载体pGL4.14（100ng）
  35μl水
2. 运行聚合酶链反应。
  将反应混合物置于GeneAmp PCR系统9700.
  PCR程序：
  步骤1：94℃5分钟
  步骤2：94℃30秒
  步骤3：60℃2分钟
  步骤4：74°C 1分钟（重复步骤2-4，35次）
  步骤5：74℃10分钟
3. PCR扩增片段的纯化
  1. 在1％的琼脂糖凝胶上电泳PCR产物
  2. 用溴化乙锭染色凝胶
  3. 切割包括扩增的DNA片段（约1.6-kbp）的凝胶区域
  4. 使用illustra GFX PCR和凝胶带纯化试剂盒从凝胶纯化PCR扩增的DNA 注意：在这个过程中，我们用30μl无核酸酶的水洗脱DNA片段（8μl等分的洗脱液用作体外转录的模板DNA）。
在T7启动子控制下的荧光素酶mRNA的体外转录
1. 准备体外转录组合。
  在室温下混合以下组分：
  8μl模板DNA
  2μl10x反应缓冲液
  2μl10mM ATP
  2μl10mM CTP
  2μl10mM UTP
  2μl10mM GTP
  2μlT7酶混合物
  用移液器彻底混匀。
2. 在37℃，4小时孵育。
3. 加入2μlTURBO DNase（MEGAScript的组分）消化其余模板DNA，并在37℃在块培养箱中孵育15分钟。
4. 用氯化锂（LiCl）沉淀进行RNA提取
  1. 向体外转录产物中加入30μl不含核酸酶的水和30μlLiCl沉淀溶液。
  2. 用涡流混合器彻底混合。在-20°C下冷却1小时。
  3. 在4℃下以15,000rpm离心15分钟
  4. 弃去上清液，并用1ml 80％乙醇洗涤沉淀
  5. 在4℃下以15,000rpm离心15分钟
  6. 弃去上清液，用离心浓缩器CC105干燥沉淀物5分钟
  7. 将RNA重悬于20μl不含核酸酶的水中，储存于-80℃。
RNA 5'端的酶修饰
1. 用ScriptCap系统将m7G帽或m7G帽和2'-O甲基化加入到体外转录的RNA中。
  1. 用无核酸酶水将转录的RNA（50μg）的体积调节至67μl
  2. 使RNA在65℃变性10分钟，然后立即将管转移至冰
  3. 当RNA变性时，混合以下组分 10μl10x ScriptCap Capping Buffer
    10μl10mM GTP
    2.5μl的20mM SAM
    2.5μlScriptGuard RNase抑制剂
    4μl用于2'-O甲基化的5'加帽的RNA或无核酸酶的2'-O未甲基化的5'加帽的RNA的ScriptCap 2'-O-甲基转移酶（100U /μl）
  4. 向步骤C1c的反应混合物中加入4μlScriptCap Capping Enzyme（10 U /μl）和67μl变性RNA。
  5. 在37℃孵育2小时
  6. 反应产物用RNeasy Mini Kit纯化
用小鼠胚胎成纤维细胞进行RNA转染
1. 用2×10 5个小鼠胚胎成纤维细胞在1ml DMEM中接种35mm直径的培养皿，并孵育24小时。
2. 使用Lipofectamine 2000转染RNA。
  1. 在每个样品240μlOpti-MEM培养基中稀释10μlLipofectamine 2000 DNA转染试剂。
  2. 在250μlOpti-MEM培养基中稀释2μg荧光素酶RNA
  3. 添加250微升稀释Lipofectamine 2000 DNA转染试剂到250微升稀释的荧光素酶RNA。彻底混合。
  4. 在室温下孵育15分钟
  5. 添加RNA-脂质复合物到小鼠胚胎成纤维细胞，并孵育6小时
荧光素酶翻译记者测定
1. 细胞裂解物的制备。
  1. 孵育6小时后，用D-PBS（ - ）洗涤RNA转染的小鼠胚胎成纤维细胞两次。
  2. 加入100微升1×无源裂解缓冲液，收获细胞用细胞刮刀
  3. 在4℃下以15,000rpm离心15分钟
  4. 通过BCA蛋白测定确定5μl等分的上清液中的蛋白浓度
  5. 将等量上清液的等量蛋白质（通过BCA蛋白质测定确定）加入50μl荧光素酶测定试剂II（LAR II）中。
  6. 立即，根据制造商的说明，在Lumat LB 9507发光计上测量相对荧光素酶单位（RLUs）。
    
    图1.引入的RNA的荧光素酶活性。野生型和 Ifit1 缺乏（ Ifit1 ^-/- ）小鼠胚胎成纤维细胞用三种不同类型的荧光素酶mRNA（5'-未封端，5'封端，但2'-O未甲基化; 5'帽+/2'-O Me-，5'封端和2'-O-甲基化; 5'帽+/2'-O Me +）。荧光素酶活性显示为相对光单位（RLU），并且RLU的数目通过步骤E1d中测定的蛋白质的浓度标准化。数据显示为一式三份样品的平均值±SD。这些数据表明Ifit1选择性抑制5'加帽的但2'-O非甲基化（5'帽+/2'-O Me - ）荧光素酶mRNA的翻译。

致谢

这项工作改编自以下文件：Kimura等人（2013）。这项工作得到教育，文化，体育，科学技术部，日本科学技术局和卫生，劳动和福利部的资助。

参考文献

Kimura，T.，Katoh，H.，Kayama，H.，Saiga，H.，Okuyama，M.，Okamoto，T.，Umemoto，E.，Matsuura，Y.，Yamamoto，M.and Takeda， 2013）。 Ifit1通过绑定到5'加帽来抑制日本脑炎病毒复制 2'-O unmethylated RNA。 J Virol 87（18）：9997-10003。