材料和试剂

细菌菌株
1. 用pRK415质粒（载体对照）的野生型（ Vibrio vulnificus MO6-24/O ，临床分离物：生物安全水平2）
2. 具有pRK415的 fur 突变体
3. 具有pRK415-毛皮的突变体
1％人红细胞（RBC）（来自作为志愿者并用PBS缓冲液稀释以制备1％RBC溶液的健康人）
四环素（3mg/ml）（Sigma-Aldrich）
PBS缓冲液（Sigma-Aldrich，目录号：P5368）
0.02％Triton X-100（用于分子生物学的Triton X-100）（Sigma-Aldrich，目录号：T8787）
LB肉汤（见配方）

设备

振荡培养箱
离心机（14,000rpm或21,000×g）
分光光度法（540和600nm）
0.22微米过滤器

程序

在改良的Luria-Bertani（LB）中，在30℃振荡培养箱中培养5ml细菌细胞[向终浓度为2.5％（w/v）的LB添加NaCl：创伤弧菌海洋细菌，因此2.5％NaCl 使细胞快速生长]培养基补充抗生素（四环素3mg/ml）
取细菌样品并通过分光光度法在600nm测量细胞密度。
通过离心（14,000rpm，5分钟，RT）和过滤（使用注射器过滤器：孔径0.22μm）收集培养物的上清液。
从每个培养物制备无细胞上清液，并用PBS连续稀释1/2,1/4和1/8（终体积：1ml）。
将1％RBC溶液与等体积的稀释上清液在37℃孵育1小时（无搅拌）。
孵育1小时后，离心每个样品以除去未溶解的RBC（14,000rpm，5分钟，RT）。
为了使1％RBC溶液完全裂解，使用等体积的0.02％Triton X-100在37℃下1小时（无搅拌）。
每个样品离心后，取上部样品。通过分光光度法在540nm处测量裂解的RBCs样品，如Shinoda等人（1985）所述（对于540nm处的空白，可以使用没有细菌细胞的培养液）。
计算溶血活性（HU）（HU表示为显示50％溶血的稀释因子的倒数）（Shinoda等人，1985）。

代表数据

图1。溶血活性通过毛皮突变或铁剥夺而降低。在野生型（pRK415），Δfur菌株（pRK415）和Δfur菌株（pRK415-毛）培养物的上清液中的溶血活性。 V。在补充有3μg/ml四环素的LBS中生长2小时，并且每种培养物用浓度为0.1mM（+螯合剂）或0mM的（2,2'-联吡啶）2,2'-联吡啶处理4小时，无螯合剂）。野生型（pRK415）和Δfur菌株（pRK415-fur）的培养物的OD 600分别为2.0-2.5和OD 600

Δfur（pRK415）培养物为1.0-1.5。将无细胞上清液的系列稀释液加入1％RBC溶液中，并通过分光光度法测量裂解的RBC。活性表示为溶血单位（HU），稀释因子的倒数显示50％溶血（Lee等人，2013）。

食谱

LB肉汤
10g蛋白胨
10g酵母提取物
每升含有5克氯化钠

致谢

该协议已经从Shinoda等人（1985）和Lee等人（2013）修改和修改。这项工作由中国职业研究员计划通过国家研究基金会资助的教育，科学和技术部（韩国的第2009-0092822 K-HL）和海洋和极端基因组研究中心韩国土地，运输和海运部的方案（至K.-HL）。

参考文献

Lee，H.J.，Kim，J.A.，Lee，M.A.，Park，S.J.and Lee，K.H。（2013）。铁吸收调节剂（Fur）在创伤弧菌中的溶血素（VvhA）产生的调节/em>：通过Fur抑制vvhA 转录和通过Fur抑制性外切蛋白酶对vvhA 进行蛋白水解 Mol Microbiol 88 ）：813-826。
Shinoda，S.，Miyoshi，S.，Yamanaka，H。和Miyoshi-Nakahara，N。（1985）。 Vibrio vulnificus 溶血素的某些属性 Microbiol Immunol 29（7）：583-590