材料和试剂

幼仓鼠肾（BHK）细胞（ATCC，目录号：CCL-10）
基孔肯雅病毒（CHIKV）
酒石酸钾
15％酒石酸钾在Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水（PBS-D）（Sigma-Aldrich）中
35％酒石酸钾的PBS-D（Sigma-Aldrich）
Micro BCA蛋白测定试剂盒（Pierce，目录号：23235）
山羊抗小鼠IgG HRP（Sigma-Aldrich，目录号：A5278）
ABTS过氧化物酶底物系统（KPL，Kirkegaard& Perry Laboratories，目录号：50-62-00）
杀菌消毒剂
漂白
MEM（Life Technologies，目录号：11095）
碳酸钠（Sigma-Aldrich）
碳酸氢钠（Sigma-Aldrich）
吐温-20（Fisher Scientific）
热灭活胎牛血清（FCS）
十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma-Aldrich）
庆大霉素硫酸盐（Life Technologies，目录号：15710）
氯化钾（Sigma-Aldrich）
磷酸钾（一元碱）（Sigma-Aldrich）
氯化钠（Sigma-Aldrich）
磷酸钠（二价）（Sigma-Aldrich）
已完成1x MEM（请参阅配方）
PBS-D（参见配方）
洗涤缓冲液（参见配方）
阻塞缓冲区（参见配方）
碳酸盐缓冲液（pH 9.5）（参见配方）

设备

层流生物安全柜
37℃的具有5％CO 2的培养箱中
96孔板读数器（405nm吸光度滤光片）
96孔Nunc MaxiSorp板（Thermo Scientific，目录号：44-2404-2）
显微镜
T-75通气组织培养瓶（Corning，目录号：430641）
血清移液器
助洗剂
50ml锥形管
试管架
带有垫圈的可拆卸铲斗的台式离心机
称量秤具有0.01 g灵敏度
超离心机
SW28转子和38毫升和17毫升水桶
Beckman Ultra Clear离心管（25×89mm）（Beckman Coulter，目录号：344058）
Seton离心管（16×102mm）（Seton Scientific，目录号：7076）
小手持灯/闪光灯
parafilm

程序

除非另有说明，否则所有过程A和B都在BL3级别执行。因此，在未密封的容器中涉及活的完整病毒的每个步骤必须在层流生物安全柜内完成，并且在进行工作之前和之后应当观察以下制备方案。

在开始实验之前，在罩中打开紫外线5分钟
关闭紫外线灯，并用Cavicide消毒剂清洁罩下的区域。
从机罩中取出本实验不需要的所有材料。获得含有足够漂白剂的清洁废物容器，使完全容器的最终漂白浓度为10％
在除去罩之前，用Cavicide消毒剂清洁罩下的所有材料

CHIKV感染和纯化：也参见参考文献2 Sindbis病毒纯化
1. 将培养基置于37℃水浴中温热
2. 在感染之前，从含有5％CO 2的37℃培养箱中移除含有BHK细胞的T-75通气烧瓶24小时。
3. 观察细胞培养基的颜色和透明度变化。
4. 可视化细胞在显微镜下20x maginification检查单层不规则和汇合。感染前细胞需要95％-100％汇合
5. 将培养基从烧瓶中倒出，并用在1ml完全的1×MEM中的每个细胞的CHIKV的10噬菌斑形成单位（pfu）的感染复数（MOI）感染BHK细胞（感染遵循Sindbis病毒说明书，在Hernandez等人。，2005）。
6. 将具有病毒的岩石烧瓶在25℃下保持1小时
7. 向每个被感染的瓶中再加入4ml培养基
8. 将感染的烧瓶置于37℃的培养箱中1天
9. 24小时后，从培养箱中取出感染的培养瓶
10. 收获病毒：将烧瓶放在通风橱中，
  1. 将培养基从烧瓶转移到50 ml锥形瓶中
  2. 将圆锥体放在带衬垫的桶中旋转，同时仍然在罩内工作
  3. 将密封桶移至离心机，在台式离心机中以1000 x g旋转细胞培养基10分钟，以沉淀细胞碎片。
  4. 在罩内，将介质转移到新的锥形管
11. 同时旋转细胞培养基，在罩内准备梯度。
  1. 倾斜梯度：初始酒石酸钾梯度梯度。该梯度通过在用于SW28转子的超级Beckman超速离心管中小心地将12ml 15％酒石酸钾层合到6ml 35％酒石酸钾层上形成。
  2. 使用永久标记，在管外侧标记两种溶液的界面。这大约是您的病毒频带出现的位置。
12. 加入20毫升收获的病毒感染的细胞培养基到含有梯度的超速离心管轻轻，不要混合梯度。必须是重叠式广告。
13. 将梯度管放置在Beckman转子轮叶中
14. 在秤上平衡桶，使用剩余的病毒感染的细胞培养基来平衡。最终重量必须在0.03克之内。含有病毒的桶必须密封，并在从通风橱中取出前用消毒剂清洁
15. 向转子中加入桶，在24,000 rpm，4℃下旋转过夜
16. 停止旋转，并将离心机桶放置在护罩内。
  
  图1。
  
  显示（图1）是第一次旋转后的病毒带。注意，在标记的接口处看到频带。第二梯度将类似于更紧密的带，如下面所示（图2）。将会有病毒的丢失，但是第二次净化是必要的，以去除大多数剩余的污染物
  
  图2。
17. 在护罩内设置试管支架和手持灯。
18. 将超声波管放在试管架上。
19. 使用手持灯，可视化你的乐队，这将位于渐变的界面附近
20. 使用25ml移液管从包括所有完成的培养基的梯度顶部拉出
21. 使用2ml血清移液管，从梯度收集病毒带，使用光监测带
22. 用1×PBS-D从第一梯度稀释病毒至少1：2（Hernandez和Brown，2010; Hernandez等人，2005; Hernandez等人，2010 ），总共8 ml的病毒
23. 设置新渐变
  1. 向17ml Seton超速离心管中加入3ml 35％酒石酸钾，然后用6ml 15％酒石酸盐覆盖。
  2. 轻轻地覆盖上面步骤22中稀释的病毒，避免混合梯度
24. 对这些渐变重复上述步骤A13-14。
25. 在4℃下以26,000rpm离心4小时
26. 重复步骤A16-21，相应地调整移液器大小。在4°C存储收集的活病毒带，最多2周。
ELISA使用micro BCA蛋白测定试剂盒测定活的纯化病毒中的蛋白质
1. 在测定前一天晚上，通过在100μl/孔碳酸盐缓冲液中加入100ng /孔的纯化病毒来包被96孔NuncMaxiSorp板。密封板用石蜡膜，并在4℃下孵育过夜
2. 第二天早晨，通过吸取从板中移除碳酸盐缓冲液+病毒，以避免任何额外的风险形成气溶胶，不要洗。
3. 用100μl/孔封闭溶液封闭平板2小时
4. 从板上吸取封闭缓冲液，不要洗涤
5. 稀释待测试的小鼠血清样品1：100在洗涤缓冲液，并添加100微升稀释的样品到板的每个孔（可能需要尝试多个稀释，看哪个最适合您的样品）。在4℃下孵育1.5小时。
6. 吸取稀释的血清样品，用300μl/孔的洗涤缓冲液洗涤板4次，在开始新的洗涤之前除去旧的洗涤缓冲液。
7. 在洗涤缓冲液中以1:2000的稀释度加入100μl山羊抗小鼠IgG HRP。在4℃孵育1.5小时
8. 吸取第二抗体，并用300μl/孔的洗涤缓冲液洗板4次。最后用300μl/孔的洗涤缓冲液进行最后一次洗涤，用封口膜封闭平板，倒置平板，然后取出洗涤缓冲液。
9. 在锥形管中混合来自ABTS过氧化物酶底物系统（KPL）的等量溶液A和B，并向ELISA板中加入100μl/孔。在室温下孵育15分钟。
10. 停止反应与100μl的1％SDS（SDS将灭活仍然存在于板中的任何活的CHIKV，允许在该步骤后从BL3条件中移除板）。在405 nm下读板。
11. 当比较应当产生与模拟动物的免疫应答的动物的样品时，通过显着更高的OD值测定阳性ELISA结果。应进行统计分析以确定重要性。

食谱

完成MEM
MEM
10％FCS
0.1％庆大霉素硫酸盐
Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水（PBS-D）（Hernandez和Brown，2010; Hernandez等人，2005; Hernandez等人，2010）
0.2克氯化钾
0.2克磷酸二氢钾 8.0克氯化钠
1.13g磷酸二氢钠去离子水至1 L
高压灭菌20分钟灭菌
洗涤缓冲液
PBS-D
0.02％Tween-20
阻塞缓冲区
洗涤缓冲液
10％FCS或1x Sigma块
碳酸盐缓冲液（pH 9.5）
3.39克碳酸钠
5.70克碳酸氢钠去离子水至1 L
您不需要调整pH值。

致谢

这里描述的方案用于出版物Piper等人（2013）。

参考文献

Hernandez，R。和Brown，D.T。（2010）。幼仓鼠肾（BHK）细胞的生长和维持 Curr Protoc 微生物第4章：附录4H
Hernandez，R.，Sinodis，C.and Brown，D.T。（2005）。 Sindbis病毒：传播，量化和存储。 Curr Protoc Microbiol 第15章：单位15B 11。
Piper，A.，Ribeiro，M.，Smith，KM，Briggs，CM，Huitt，E.，Nanda，K.，Spears，CJ，Quiles，M.，Cullen，J.，Thomas，ME，Brown， Hernandez，R。（2013）。基孔肯雅病毒宿主范围E2跨膜缺失突变体诱导针对C57BL/6J小鼠中攻击的保护性免疫。 a> J Virol 87（12）：6748-6757。