材料和试剂

从常规扁桃体切除术获得的扁桃体组织（患者年龄范围：2-10）
从常规子宫切除术获得的宫颈阴道组织（患者年龄范围：35-55）
Gelfoam 12-7mm可吸附明胶海绵（Pfizer，NDC：0009-0315-08）
RPMI 1640（Life Technologies，Gibco ，目录号：31870-025）
100x改良Eagle培养基（MEM） - 非必需氨基酸（10mM）（Life Technologies，Gibco ，目录号：11140-035）
100×MEM丙酮酸钠（100mM）（Life Technologies，Gibco ，目录号：11360-070）
1,000x庆大霉素（50mg/ml）（Corning，cellgro ，目录号：30-005-CR）
100x Fungizone（250μg/ml，两性霉素B）（Life Technologies，Gibco ，目录号：15290-018）
胎牛血清（FBS）（Gemini Bio-products，目录号：100-106）
注意：我们建议测试几批血清进行文化优化，并对整个系列实验使用相同批次的FBS。我们总是在几个供体的组织上测试几个血清批次，并选择给出最高HIV-1复制的批次。此外，FBS可影响组织在培养基中分泌细胞因子的能力。
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（pH 7.4）（Life Technologies，Gibco ，目录号：10010-023）
无菌水，细胞培养级（Quality Biological，目录号：118-162-101）
HIV-1病毒制剂
注意：对于我们的大多数实验，我们使用从病毒学质量保证实验室获得的以下病毒制备物：HIV-1 subAbL和HIV-1 subAID0.04 Rush大学（芝加哥，IL）。病毒原种获自用HIV-1 SubLaL或HIV-1 SubLa.04.04接种的外周血单核细胞培养物的澄清培养基，最初来自NIH AIDS试剂程序。对于HIV-1 subLaL和HIV-1 subAgL 1，HIV-1 p24agag浓度为49±3ng/ml和53±3ng/ml。/sub> stock。对于我们的实验设置中使用的更多病毒制剂，参见Introini等人，2013和Vanpouille等人，2012年。
Timentin（GlaxoSmithKline，NDC：0029-6571-26）（参见配方）
注意：Timentin是作为单独试剂可商购的抗生素替卡西林和克拉维酸的混合物的商品名。这些抗生素有效地防止在手术后偶尔可能污染组织样品的细菌的生长。可以使用青霉素和链霉素代替特美汀，尽管它们具有不同的性质。例如，特美汀在室温或37℃（约24小时）显示出低稳定性，因此，一旦加入到培养基中，其仅在培养的第一天保持活性。
培养基（CM）（见Recipes）

设备

培养皿（100mm×20mm）（BD，Falcon，目录号：353003）
培养皿（150mm×25mm）（BD，Falcon ，目录号：353025）
6孔板（Corning，Costar ，目录号：3506）
12孔板（Corning，Costar ，目录号：3513）
5，10-ml移液管（BD，Falcon ）
密封螺旋盖1.5/2ml管（SARSTEDT AG）
具有用于1.5ml管（Eppendorf）的块的热混合器
镊子或镊子
手术刀和刀片 10和23
剪刀
平称重金属刮刀
37℃，设定在90％湿度的5％CO 2培养箱中
水浴
10，50 ml注射器活塞

程序

让CM有足够的时间达到室温或将其放在37°C预热的水浴中

根据所用组织的类型和进行实验所需的孔数（表1），计算每次实验所需的明胶海绵片数量（表1）。

表1.文化设置

组织类型	海藻块数（1海绵）	文化板	培养基体积（每孔）（ml）	块数（每个明胶块）	每个实验条件下的孔数（重复）
Tonsillar	4	6井	3	9	3或更多
宫颈阴道	5-6	12孔	1	8	2以上

根据所需的明胶海绵块的数量，或者用约200ml补充有特美汀的CM填充100mm×20mm培养皿或者用约200ml填充150mm×25mm培养皿（如果需要超过3个海藻糖海绵）。
使用乙醇灭菌钳将明胶海绵放入培养皿中，使用用乙醇灭菌的弯曲平刮刀将海绵压在培养皿底部约2分钟。
注意：当脱水时，明胶海绵极脆。水合过程应该小心，特别是当向下推泡沫以追逐空气时。明胶海绵应该尽可能没有空气：存在空气会阻塞营养物质通过其进入组织的毛细血管。
使用乙醇灭菌剪刀将再水化的明胶海绵切成适当大小的片（表1）。
使用镊子将一块明胶海绵放入每个孔，并用移液管加入适量的含有特美汀的CM（表1）。
将板放入培养箱。
注意：解剖和感染方案因使用的组织而异。如果使用扁桃体遵循选项A; 如果使用宫颈阴道组织，按照选项B.

扁桃体组织
1. 将一个扁桃体放入一个100毫米的陪替氏培养皿中含有补充了特美汀的CM，并将扁桃体切成几个大片（4-5片）。
2. 转移一块进入含有几毫升CM的培养皿的盖子。盖住含有剩余扁桃体片的培养皿，以避免组织干燥。
3. 用10或23号刀片手术刀和镊子，去除烧灼部分和纤维组织。去除血腥/发炎的组织和任何含有扁桃体和/或绿棕色的部分（图1，参见Grivel和Margolis，2009的附加图片）。
  
  图1.制备用于培养的扁桃体组织
  （上）在接受的外科手术标本中，应该切除的部分是来自胶囊周围腭扁桃体（白色），烧灼组织（棕黑色），血腥/发炎组织（红色）绿色。
  （中）用镊子夹住样品的整齐切口去除不需要的大部分组织。虚线界定切割表面以移除烧灼组织层。对于小部件，可能更容易用钳子直接夹住它们以将其切除。
  （向下）将组织条切割成约8mm 3的块。将9个块转移到6孔板中的每个明胶片上。
4. 将组织切成约2mm厚的切片。如上所述去除任何不需要的部分，并将切片切成2mm厚的条。然后将条切成2 mm厚的块。这将导致大约8毫米³的块。
5. 根据需要切割多个块，每个实验条件需要至少27个块（表1）。用镊子，将块转移到含有CM补充的干净培养皿中，以避免组织块脱水，同时进行解剖。
  注意：由于解剖可能需要很长时间，因此重要的是要在培养皿盖上加入培养基，以便在切割时保持组织湿润。
6. 旋转板以随机化块的分布。
7. 从培养箱中取出含有Gelfoam的六孔板，并使用镊子在每个Gelfoam片的顶部放置9块组织。
8. 将板放回培养箱过夜培养或进行感染（转到步骤A11）。
  注意：我们优选在过夜孵育后进行感染，以确保没有细菌或真菌污染发展。此外，大量的细胞在解剖后流出扁桃体组织块。这个过程大部分在前24小时的文化中完成。
9. 如果前一天晚上解剖组织，用移液管吸取六孔板中的CM，并丢弃。倾斜板，轻轻地推动明胶海绵回到井的上部，让介质聚集在底部，吸出并丢弃它。
10. 用移液管，向每个孔中加入在37℃预热的3ml含有特美汀的CM。
11. 解冻HIV-1病毒制剂在37°C预热的水浴中。如有必要，将病毒原液稀释至适当浓度。优选具有稀释物，使得所需的接种物包含在5至8μl的培养基中注意：对于我们的大多数实验，我们使用6.0至7.5μl未稀释的HIV-1BaL或HIV-1LAI.04病毒原液（材料和试剂12）感染每个扁桃体组织块。对于有效的感染，至关重要的是允许解冻HIV-1病毒制剂和将接种物沉积在组织块上之间所需的最短时间。
12. 将接种物直接移植到Gelfoam片上的9个块的顶部注意：为了精确输送接种体积，我们建议使用反向移液技术，并更换每个孔的尖端。
13. 感染完成后立即将培养板放回孵育器。
宫颈阴道组织
1. 将组织片放在含有CM补充的Timentin的100-mm培养皿中。
2. 转移一块组织到含有几毫升CM的培养皿的盖子。盖住含有剩余组织的培养皿以避免干燥。
3. 用23号刀片手术刀和镊子分离外宫颈粘膜和子宫颈粘膜从下面的基质组织获得粘膜条（图2）。
  
  图2.准备用于培养的宫颈阴道组织
  （Up）宫颈内膜是子宫内衬管腔的一部分，提供子宫腔和阴道间的连通。子宫颈的通过上前阴道壁突入阴道的部分称为外宫颈。在接受的宫颈阴道组织标本中，宫颈内粘膜容易被识别为具有深红色的部分，并且被厚粘液包裹，而外宫颈粘膜具有更清晰的颜色。
  （中）可以将外科手术标本切成更小的片以便于除去粘膜。用钳子保持基质组织，将其与粘膜切割组织标本在纵向（由箭头指示）相对于粘膜层。虚线限定切割表面并且应位于组织标本的上皮边缘下方2-3mm处。
  （向下）将粘膜条切割成约8mm 3的块。感染后，在12孔板中的每个凝胶块上转移8个块
4. 将粘膜条切成2mm厚的条，除去并丢弃尽可能多的结缔组织肌肉组织，仅留下包含粘膜上皮，粘膜下层和部分基底基质的2mm厚的层。将条切成2 mm厚的块。这将导致大约8mm ³的块。
5. 根据需要切割多个块，每个实验条件需要至少16个块（表1）。用镊子，将块转移到含有CM补充的干净培养皿中，以避免组织块脱水，同时进行解剖。
  注意：对于我们的大多数实验，我们从endocervix和ectocervix集合块。可以考虑保持它们分离，因为它们具有不同的结构和免疫特征（Pudney等人，2005）。此外，宫颈内膜通常在培养物中继续产生粘液，这可能干扰后续测定。注意，在接收的宫颈阴道组织标本中，宫颈内膜远小于外宫颈。
6. 旋转板以随机化块的分布。
7. 用镊子，将块转移到无菌的1.5毫升锥形管（s）（每管最多16块）。
8. 解冻HIV-1病毒制剂在37°C预热的水浴中。如有必要，将病毒原液稀释至适当浓度，并将其转移到含有块的管中注意：
  a。 Cervico阴道组织在解剖时最好被感染。我们建议包括实验条件，其中将病毒和强大的抗病毒药物组合。这是一个有用的控制，以确定病毒是否实际复制，而不是被组织吸附和释放。
  b。对于我们的大多数实验，我们使用500μl未稀释的HIV-1BaL病毒原液（材料和试剂12）感染12-16个宫颈阴道组织块。我们在HIV-1制剂中添加拉米夫定10μM，在整个培养长度期间添加CM作为HIV-1释放的对照。
9. 将管转移到在37℃预热的Thermomixer中，并以300转/分钟设定混合。孵育2小时，每半小时轻轻倒转管数次。
  注意：对于有效的感染，允许在解冻HIV-1病毒制备物和将管转移至37℃之间所需的最短时间是至关重要的。
10. 用3-4ml PBS填充6孔板的孔（如果超过6个管用于感染，则更多的板）。
11. 从试管中弃去病毒制剂。使用镊子，轻轻地将块传递到6孔板盖以去除残留在块上的过量的病毒制备物，然后将块转移到含有PBS的孔中。
12. 用吸管轻轻旋转，等待1分钟。用移液管吸入PBS，小心不要吸入块。
13. 加入3-4毫升PBS的孔，用吸管尖轻轻旋转，等待1分钟。
14. 重复步骤B12-13三次。
  注意：这些洗涤步骤是必要的，因为在宫颈阴道组织中的HIV-1复制不像在扁桃体组织中那样高，并且可以被随后释放的吸收在组织上的病毒掩盖。
15. 取12孔板从孵化器，并使用镊子转移8块在每个Gelfoam片的顶部。
16. 将板放回培养箱。

A和B共有

感染HIV-1后三天，从每个重复孔中收获一份培养基，并将其转移到螺旋盖管中。
注意：我们通常会将重复井的等分试样混合。
使用乙醇灭菌镊子放回可能从明胶海绵掉下的任何块组织。
用移液管，从板上丢弃剩余的介质。倾斜板，轻轻地带上明胶海绵到井的上部，让介质向下流到底部，吸出并丢弃它。
用移液管加入足够体积的预热至37℃的新鲜CM（表1）注意：在这个阶段不需要补充CM与Timentin。
将板放回培养箱。
将培养基等分试样储存在-80℃。
每3天重复步骤1至5，直到第12-15天。
在感染后12-15天，使用镊子收集组织块，并根据实验需要处理它们。
对于RNA提取，我们通常在4℃下将组织块保持在RNA中过夜，然后将其储存在-80℃。对于流式细胞术，我们立即通过用酶混合物消化组织块来处理组织块获得单细胞悬液。
注意：在文化期间，组织长出到明胶海绵片。单个细胞也可以从组织迁移到凝胶中。可以通过用镊子夹紧凝胶，分别分析凝胶上方的组织部分。凝胶内的细胞可以使用镊子或注射器柱塞挤出。然而，应该记住，从凝胶中提取的不仅仅是迁移细胞的一部分，而是这些细胞和组织结构的混合物。
根据机构处理人类传染性废物所需的生物安全措施，将板块与任何残留的CM，组织块和明胶海绵一起处理。

许多技术可用于评估HIV-1在组织块中的产生和复制。我们的标准读出是使用基于荧光珠的免疫测定法（Biancotto等人，2009）在整个培养时间收获的培养物上清液中测量HIV-1p24ag gag。
注意：用相同HIV-1原种的相同接种物感染的来自不同供体的组织可以通过培养物上清液中的p24 gag积累测量得到不同的结果（表2）。这可能是由于几个因素，例如HIV-1靶细胞的数量和活化状态以及共感染病原体的存在，其影响HIV-1在组织块中的复制和产生。因此，在实验的不同条件的设置中使用来自仅一个供体的组织（供体匹配条件）是至关重要的。

表2. HIV-1p24 gag接种物的参考值和在组织外植体中的相对产量 HIV-1 p24 gag 生产被表示为累积的在培养12天（第6天+第9天+第12天）中每3天取样培养上清液中测量的p24 gag值的值。排除了在第3天测量的p24 gag的值，因为它还包含从HIV-1接种物释放的p24 gag从新吸收的组织块连同新产生的p24 _{> gag}作为病毒复制的结果。通过在感染的供体匹配的块的培养物上清液中测量的p24qag值来归一化感染有HIV-1 subLaL的子宫颈阴道组织中的HIV-1产生的值，在拉米夫定10μM的存在下培养。感染HIV-1 sub-LAI.04的子宫颈 - 阴道组织不会导致我们的HIV-1复制实验设置。使用基于荧光珠的免疫测定法测量HIV-1p24ag gag（Biancotto等人，2009）。

组织类型	病毒	每块的接种物（pg HIV-1 p24 sub gag ）	块数	HIV-1 p24 _gag production（ng/ml）
Tonsillar	HIV- _1BaL	367.5	27	1-10
	HIV-1 LAI.04	397.5	27	10-100
宫颈阴道	HIV- _1BaL	1531.2	16	1-5
宫颈阴道	HIV- _1LAI.04	1656.2	16	检测不到

笔记

对于我们的实验，我们使用从指示的手术收集的组织，其不是为了研究的目的而收获的，因此可以被认为是"病理性废物"。在任何情况下，人体组织必须根据伦理审查委员会批准的方案收获。从组织供体收集个人和医疗数据，例如使用药物，月经周期，性行为，使用避孕药等可以提供重要的信息来解释实验结果。例如，参见Saba等人，2013年。收集这些数据提出了关于知情同意和隐私的伦理问题，必须在组织收获方案中解决。
输送到实验室的组织应处于良好状态，具有"健康"的粉红色，并且缺乏大血块和绿色坏死中心。组织的状态还取决于其被递送用于处理的速度。对于长期培养来说，用健康的组织开始实验是重要的。扁桃体组织是软的并且易于变质。根据我们的经验，这种组织应该在手术后3-5小时内交付。我们注意到，在交付期间在冰上冷却使其不太适合长期培养。因此，我们在传送过程中在室温下在PBS中维持扁桃体组织。宫颈阴道组织更坚固，我们成功感染艾滋病毒1和培养组织24 h后手术。我们使用冰冷的RPMI 1640作为输送介质
应该告知操作者关于使用血源性病原体的风险，并接受适当的培训以在生物安全2级实验室中工作，以便处理组织标本，即使实验不涉及使用HIV-1。
注意和图片为更细致的实验者，任何特点的组织标本，你怀疑可能会影响实验结果，如血腥，烧灼和坏死部分。我们建议保留进行解剖的介质以及任何未使用的组织，因为它们可能有助于评估细胞活力，归档DNA/RNA或组织学分析。
优化表2中报告的HIV-1接种物的值以进行感染，其中将病毒储存的组织标本递送至实验室，并按照标准程序进行处理以最小化不是由于组织的固有性质引起的任何变化。然而，HIV-1的产生在来自不同供体的组织之间显着变化。因此，我们邀请读者将表2中报告的值作为参考，同时铭记多个捐赠者间因素会影响感染的结果。因此，我们建议只使用捐献者匹配的实验条件，并对来自多个捐献者的平均数据进行适当的统计分析
上述实验系统是非极化的，意味着HIV-1的穿透可以发生在组织块的所有侧面。该系统的目的不是模拟通过上皮的HIV-1传输，而是调查调节组织中HIV-1传播的机制。对于子宫颈阴道组织，这种培养系统仍然可以模拟HIV-1传输，因为在体内有证据证明HIV-1可以通过预先存在的上皮微阵列到达粘膜的上皮上层造成性交。具有HIV-1的极化感染和组织外植体培养物的实验设置已由Dezzutti和Hladik，2013中的其他人描述。这两种系统作为HIV-1传播模型的优点和缺点在Merbah等人，，

食谱

特美汀
通过加入100 ml无菌水到3.1 g小瓶的特美汀制备一个工作的100x储备溶液。在无菌螺帽管中等分，冷冻并保持等分在-30℃。未使用的解冻等分试样应丢弃。
培养基（CM）
从500 ml的RPMI1640瓶中取出90 ml（留作其他用途）
添加
75 ml FBS
5ml的100×MEM非必需氨基酸
5ml 100x的菌剂
5ml的100×MEM-丙酮酸钠 500μl1,000x庆大霉素
储存在4°C
仅在使用前补充CM与特门汀。稀释1毫升新鲜解冻的100x特美汀在99毫升CM。考虑到需要额外的CM来制备明胶海绵和切割的组织，根据表1中的指示准备实验所需的体积。
注意：我们通常准备大量的CM（4瓶），我们存储在4°C，并使用从培养2周内培养组织。较旧的CM可以用于在解剖期间保持组织块，在补充之后 Timentin。

致谢

该协议改编自以下出版物： Introini等人（2013）和Grivel和Margolis（2009）。这项工作得到了Eunice Kennedy Shriver国家儿童健康和人类发展研究所的校内方案的支持。

参考文献

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Dezzutti，C. S.和Hladik，F。（2013）。使用人体粘膜组织研究HIV-1发病机制并评估HIV-1预防模式。 HIV/AIDS Rep 10（1）：12-20
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