材料和试剂

蛋准备
每个培养皿使用100个鸡蛋。测定一式三份。
LB肉汤
胆固醇
乙醇
CaCl <2>
MgSO 4 4 /
KPO ₄
在乙醇中的3.7％（v/v）1-辛醇（Merck KGaA，目录号：820931）在滴定测定后建立该浓度，以找到快速响应所需的最低浓度（在分钟范围内）（Olmedo等人，2012）
NGM板（参见配方）
注意：对于一个实验，总是使用从相同批次倾倒并允许干燥相同时间量的板。
大肠杆菌（大肠杆菌）OP50培养物以100g细菌湿重/升

设备

标签板模板（图1）

图1.板标记模板。在一张纸或塑料上画一个5厘米直径的圆，在其中放置培养皿和一个同心的直径为1厘米的圆圈，以标记该点 e。大肠杆菌下降。用圆点标记此圆（A）的中心。在离圆心中心0.8cm处绘制一个点（B）。
5厘米培养板
用于图像采集的立体显微镜（我们使用Zeiss的Stereo Discovery V8放大10倍）。
离心机

程序

加入15μl的100g湿重/L em。大肠杆菌 OP50培养物至NGM板的中心（在A内）。
注意：您可能需要优化您的立体显微镜下降的大小，以便拍摄的照片显示整个下降。 15μl大肠杆菌将形成直径约1cm的圆形。
让滴干，并允许细菌在室温下生长O/N。
在 E上添加约100个鸡蛋。大肠杆菌下降。在所需的条件下生长蠕虫，直到你想要嗅觉的发育阶段。
注意：对于昼夜节律实验，我们在13℃的16小时和16℃的8小时的温度循环下生长蠕虫。这个24小时的周期重复5次，直到蠕虫成为年轻的成年人。然后，每小时进行趋化性测定24小时，以寻找对1-辛醇的响应中的昼夜节律。
趋化性测定：将NGM板放置在模板上，并使EM中心。大肠杆菌随模板的圆圈。
打开盖子，在点B加入1μl的1-辛醇。注意1-辛醇不接触 E。大肠杆菌下降。如果是，丢弃板（因为与1-辛醇/乙醇溶液直接接触的蠕虫会死亡）。
关闭板的盖子，并在所需的温度下孵育15分钟。
注意：对于昼夜节律实验，该测定可以在恒定条件下或在用于夹带蠕虫的相同循环下进行24小时。在两种情况下，将板在加入1-辛醇前相同的温度下温育15分钟。
拍摄蠕虫的最终位置的图片。始终将1-辛醇的点保持在图片的相同位置（图2）。

图2. E的最终图片。大肠杆菌下降对1-辛醇反应较强的平板
在图片上，绘制一条垂直线，将1厘米圆分成两等份（图3）。计算在圆的近端（p）和远端（d）中的蠕虫数量。与中间线相交的蠕虫不计入。
计算趋化指数（CI = d-p/p + d）。

图3.趋化指数的计算。通过计数圆的近端（p）和远端（p）中的蠕虫并应用公式CI = d-p/p + d来计算趋化性指数。

食谱

NGM板
准备NGM媒体：
注意：在同一批次中准备所有实验板并允许它们同时干燥是非常重要的。板的湿度水平的变化将在测定中引入变异性
1. NGM培养基：混合3g NaCl，17g琼脂和2.5g蛋白胨。加入975ml dH 2 O并搅拌混合。将一半内容物倒入第二个烧瓶中并高压灭菌。在55°C水浴或培养箱中冷却培养基至少30分钟。
2. 使用无菌条件，加入1ml 1M CaCl 2，1ml 5mg/ml胆固醇的乙醇溶液，1ml 1M MgSO 4和25ml 1M KPO ₄缓冲液并混匀。
  使用泵将10ml的NGM溶液分配到5cm培养皿中。使板在室温下放置2天，然后使用，以使过量的水分蒸发
100g湿重/L E。大肠杆菌 OP50培养物
挑取一个单一菌落的OP50细菌并接种在200ml LB肉汤中。在37℃生长O/N。在5,000xg离心培养物10分钟。取出上清液，计算细菌的湿重，并使用LB肉汤调整浓度。

致谢

该方法基于最初在Olmedo等人（2013）中发表的工作。这项工作得到了荷兰科学基金会（NWO; VICI计划）的支持。

参考文献

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Granados-Fuentes，D.，Ben-Josef，G.，Perry，G.，Wilson，D.A。，Sullivan-Wilson，A.and Herzog，E.D。嗅觉歧视中的每日节律依赖于时钟基因，但不是视交叉上核。 J Biol Rhythms 26（6）：552-560。

Krishnan，B.，Dryer，SE和Hardin，PE（1999）。嗅觉反应中的昼夜节律 400 400（6742）：375-378。

Olmedo，M.，O'Neill，J.S.，Edgar，R.S.，Valekunja，U.K.，Reddy，A.B.and Merrow，M。（2012）。嗅觉的环境调节和在Caenorhabditis elegans中的进化保守，非转录标记。 Proc Natl Acad Sci US A 109（50）：20479-20484。
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