材料和试剂

通过酶解离从新生Sprague-Dawley大鼠分离的心室心室成纤维细胞（Lee等人，2013）
注意：我们的方案可用于各种细胞类型，如成骨细胞和血管平滑肌细胞。
具有高葡萄糖和4mM L-谷氨酰胺（Hyclone，目录号：SH 30243.01）的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）
胎牛血清（FBS）（Hyclone，目录号：SH30919.03）
无机磷酸盐（Pi）（pH 7.4）
DPBS，不含Ca 2+和Mg 2+ 2+（Hyclone，目录号：SH 30028.02）。
胰蛋白酶/EDTA（Hyclone，目录号：SH30042.01）
70％乙醇
蒸馏去离子水（DDW）
0.6 N HCl溶液
裂解液
0.1 N NaOH
0.1％十二烷基硫酸钠（SDS）
QuantiChrome钙测定试剂盒（BioAssay Systems，目录号：DICA-500）
工作试剂（详见QuantiChrome Calcium Assay Kit手册）（BioAssay Systems，目录号：DICA-500）（参见参考文献2）
Bio-Rad DC蛋白测定试剂盒（Bio-Rad Laboratories，目录号：500-0016）
稀释的蛋白质标准品（例如，0,2,4,6,8,12,16和20 mg/dl）
100ng/ml NF-kB配体的受体激活剂（RANKL）（Sigma-Aldrich，目录号：R0525）
5％硝酸银水溶液（Sigma-Aldrich，目录号：S7279）（参见Recipes）
5％硫代硫酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：S7026）（参见Recipes）
2％茜素红S溶液（Sigma-Aldrich，目录号：A5533）（参见Recipes）
1M NaH 2 PO 4（pH 7.4）（Sigma-Aldrich，目录号：S6566）（参见配方）。

设备

48孔板
96孔板
分光光度计或96孔读数器
37℃，5％CO 2细胞培养箱中培养
倒置显微镜
吸气器
紫外可视化仪
高功率灯（60-100瓦）

程序

钙沉积物的检测
1. Von Kossa染色
  1. 在500μl含有10％FBS的DMEM中，在不存在或存在3mM无机磷酸盐（Pi; pH值）的情况下培养心室心室成纤维细胞（在48孔板中2×10 4个细胞/7.4）在37℃，5％CO 2细胞培养箱中培养6天，用于诱导矿化。介质每2天更新一次。
    注意：用于通过高浓度的无机磷酸盐诱导心脏成纤维细胞中的异位钙化
  2. 将培养的细胞用250μlDPBS冲洗两次，并在室温下固定在250μl冰冷的70％乙醇中1小时，无需任何搅拌。
  3. 固定后，取出DPBS和乙醇，并仔细用DDW冲洗。
  4. 在固定细胞顶部吸入DDW后，加入250μl5％硝酸银溶液，将细胞容器置于明亮的光照下，如阳光，紫外光或高瓦灯，直到钙沉积物变成适当的黑色（或深棕色）。
  5. 轻轻振荡，轻轻冲洗3次250μlDDW。
  6. 冲洗未反应的银与250微升5％硫代硫酸钠，并在室温下保持5分钟（可选）。
  7. 轻轻振荡，轻轻冲洗3次250μlDDW。
2. 茜素红S染色
  1. 固定培养细胞与250微升冰冷的70％乙醇在室温下1小时。
  2. 用250μlDDW洗涤3次后，用250μl2％茜素红染色溶液在室温下染色细胞30至60分钟。
  3. 用250μlDDW冲洗2次。
  4. 用DDW除去未掺入的过量染料后，矿化结节被染成红色斑点
钙定量
使用如制造商说明书所述的QuantiChrome钙测定试剂盒比色测定上清液的钙含量。简而言之，
1. 培养的细胞用250μlDPBS洗涤两次，并用250μl0.6N HCl脱钙12小时。
2. 通过混合等体积的试剂A和B制备工作试剂。使用前平衡至室温。
3. 将5μl稀释的标准品或样品转移到透明底部96孔板的每个孔中。
4. 加入200微升工作试剂，轻轻点击混合。
5. 在室温下孵育3分钟后，用96孔读数器读取570-650nm的吸光度。
6. 剩余的细胞用250μlDPBS洗涤三次，并在室温下溶解在200μl含有0.1N NaOH和0.1％十二烷基硫酸钠（SDS）的裂解溶液中5分钟。
7. 用Bio-Rad DC蛋白测定试剂盒测定蛋白质含量。
8. 钙含量相对于全细胞的总蛋白质含量（μgCa 2+/mg/mg蛋白质的全细胞，参见图1）标准化。
  
  图1. RANKL对Pi诱导的心脏成纤维细胞钙化的协同效应（Lee 等，2013）强>在缺乏或存在100ng/ml RANKL的情况下用3mM PI处理原代心脏成纤维细胞3天。测量细胞中的钙含量，通过von Kossa染色观察钙沉积物。代表性图像显示在顶部面板中。比例尺，100μm（上图）。通过QuantiChrome Calcium Assay试剂盒（下图）测量钙含量。定量数据为平均值±SD（n = 3）。

食谱

5％硝酸银水溶液
将5g硝酸银溶于100ml DDW中
5％硫代硫酸钠
将5g硫代硫酸钠溶于100ml DDW中
2％茜素红S溶液
将2g茜素红S（茜素磺酸钠）溶解在100ml DDW中，用0.5％氢氧化铵将pH调节至4.1-4.3。
1 H NaH 2 PO 4（pH 7.4）
在10ml DDW中溶解1.2g NaH 2 PO 4，并使用NaOH将pH调节至7.4。

致谢

此协议改编自先前发表的报告Lee等人（2013）和QuantiChrome Calcium Assay Kit手册。

参考文献

Lee，K.，Kim，H.，Park，HS，Kim，KJ，Song，H.，Shin，HI，Kim，HS，Seo，D.，Kook，H.，Ko，JHand Jeong， 2013）。靶向破骨细胞RANKL-RANK轴可预防柯萨奇病毒B3感染的骨质疏松性骨质流失和软组织钙化小鼠。 J Immunol 190（4）：1623-1630。
QuantiChrome钙测定试剂盒手册。 http://www.bioassaysys.com/file_dir/DICA.pdf 。