材料和试剂

动物
我们通常使用来自白化Sprague Dawley大鼠的视网膜。该方法用于培养在胚胎第17天至出生后第1天之间的大鼠视网膜。来自小鼠视网膜的年轻和较老的视网膜细胞或视网膜细胞在这些条件下似乎不能存活，但也可以培养。
DPBS（Life Technologies，目录号：14040）
Neurobasal培养基（Life Technologies，目录号：21103-049）
DMEM/F12培养基（Life Technologies，目录号：10565-018）
B27补充剂（Life Technologies，目录号：17504-044）
Pen/Strep（P/S）（Life Technologies，目录号：15140-122）
聚L-赖氨酸（PLL）（Sigma-Aldrich，目录号：P-4707）
小鼠层粘连蛋白（Life Technologies，目录号：23017-015）
木瓜蛋白酶（Worthington Biochemical，目录号：LS003126）
L-半胱氨酸晶体（Sigma-Aldrich，目录号：C-7352）
胰蛋白酶抑制剂（Roche Diagnostics，目录号：109878）
0.45μm和0.22μm过滤器（Fisher Scientific，目录号：SLHV033RS和SLGP033RS）
Hoechst 33342（Life Technologies，Molecular Probes ，目录号：H3570）
"未完成"RGM介质
生长因子（参见食谱）
1. bFGF（Pepro Tech，目录号：100-18B）
2. EGF（Pepro Tech，目录号：315-09）
3. NT-3（Pepro Tech，目录号：450-03）
4. BDNF（Pepro Tech，目录号：450-02）
10x Lo Ovomucoid（参见配方）
20x 4％BSA（Sigma-Aldrich，目录号：A-4161）（参见Recipes）
0.4％DNase（Worthington Biochemical，目录号：LS002007）（参见Recipes）
胰岛素（2.5mg/ml）（Sigma-Aldrich，目录号：I-6634）（参见Recipes）
cpt-cAMP（Sigma-Aldrich，目录号：C-3912）（参见Recipes）
N-乙酰半胱氨酸（NAC）（Sigma-Aldrich，目录号：A-9165）（参见Recipes）
福斯克林（Sigma-Aldrich，目录号：D-2438）（参见Recipes）
N2补充（见配方）
4％多聚甲醛（Electron Microscopy Science，目录号：15710）（参见配方）
Apo-Transferrin（Sigma-Aldrich，目录号：T-1147）（参见Recipes）
孕酮（Sigma-Aldrich，目录号：P-8783）（参见Recipes）
腐胺（Sigma-Aldrich，目录号：P-5780）（参见Recipes）
钠Selinite（Sigma-Aldrich，目录号：S-5261）（参见Recipes）

设备

35mm培养皿（BD Biosciences，Falcon ，目录号：353001）
50ml锥形管
CO <2>孵化器
15 ml锥形管
100 mm培养皿
CO 2室
直线力
Fine forcep（Fine Science Tools，目录号：11252-23）
弯曲力（Fine Science Tools，目录号：91197-00）
锋利的剪刀
层流罩
水浴
P1000移液器
显微镜
血细胞计数器
离心机

程序

实验前一天

用聚-L-赖氨酸和层粘连蛋白包被培养皿
1. 通过在无菌水中稀释储备溶液制备聚L-赖氨酸（PLL）的50％工作溶液。向每个35mm培养皿中加入1.5ml PLL溶液。在室温下放置60分钟。取下PLL，在机罩内干燥。用无菌水洗三次。
2. 在冷的Neurobasal培养基中制备浓度为5μg/ml的小鼠层粘连蛋白溶液。加入1.5毫升小鼠层粘连蛋白溶液到盘中。
3. 在37℃和8％CO 2平衡的培养箱中孵育至少过夜。 5％CO 2孵育确定，但对于Neurobasal/DMEM/F12培养基混合物不是最佳的。可以进行更长时间的孵育，并且发现可以提高制备的质量
准备"不完全"视网膜生长培养基（RGM）
1. 在50ml锥形管中，在无菌条件下，添加以下：
  10ml神经基础培养基
  10ml DMEM/F12培养基
  100μlN2补助剂
  200微升B27补充剂
  200μl100x Pen/Strep（P/S）
  200微升6毫克/毫升NAC
  40μl50mM cpt-cAMP
  20μl10mM Forskolin
  200μl2.5mg/ml胰岛素
  使用先前用Neurobasal培养基漂洗的0.22μm过滤器对溶液进行过滤灭菌。并在4℃储存直至需要

实验日

准备所需的解决方案（见配方的储备溶液的制备）
1. "不完全"RGM培养基添加生长因子
  4μlEGF250μg/ml
  2μlb-FGF100μg/ml
  20微升BDNF 50微克/毫升
  5μlNT-3100μg/ml
  为了在适当的温度和pH下平衡培养基，将盖子放在50ml管上并旋开¼圈。将管置于37℃和8％CO 2的培养箱中直至需要
2. 木瓜溶液
  在15ml锥形管中加入以下
  10ml DPBS
  5μl1N NaOH
  100 U木瓜蛋白酶溶液
  100μl0.4％DNase
  2mg L-半胱氨酸晶体（仅在使用溶液解离之前加入）
  在37℃水浴中保持
3. LO-OVO解决方案
  9 ml DPBS
  1ml 10×LO-OVO / 100μl0.4％DNase
  在37℃水浴中保持
文化程序
注意：解剖应在无菌条件下进行。用70％乙醇喷洒工作区域并使用火焰。在使用前消毒所有仪器。
准备两个100毫米的菜充满了10毫升的无菌DPBS，一个转移头和其他解剖的眼睛和两个35毫米的菜，填充2毫升无菌DPBS收集视网膜。
1. 胚胎的集合
  1. 在CO 2室中对动物安乐死。
  2. 将动物放在它的背部，用70％乙醇清洁腹部皮肤。
  3. 捏直皮肤与直的forcep，抬起皮肤和肌肉和使用剪刀在腹部的两侧做一个V形开口从下腹部开始，一直切到侧面这个动物。抬起皮肤和肌肉向上，揭示内部器官和子宫。
  4. 切出子宫并将其转移到150mm的皿中。
  5. 从子宫中取出胚胎，用锋利的剪刀摘下头。
  6. 将头转移到填充有DPBS的100mm皿中。
2. 视网膜的解剖
  1. 小心去除覆盖眼睛的皮肤。
  2. 放置一个弯曲的forcep的两侧的眼睛，并施加温和的压力。眼睛应该小狗。
  3. 捏紧眼睛的后面，拉。
  4. 将眼睛转移到填充有DPBS的100mm皿中。
    1. 使镜片面朝下，用细镊子将眼睛固定在适当位置，并去除视神经（图1，步骤1-2）。
    2. 通过视神经头引入另一镊子的尖端在脉络膜和视网膜之间以固定巩膜。
    3. 现在巩膜是固定的，你需要轻轻地撕开它与两者打开镊子从视神经头到角膜以暴露视网膜透镜（图1，步骤3-4）。
    4. 小心取下镜头将视网膜放置在填充有DPBS的35mm培养皿中（图1，步骤 5-6）。从E18-19起，需要去除血管覆盖视网膜以避免内皮细胞污染文化。
    5. 血管形成上覆的微红色膜视网膜的内表面。膜通过夹紧容易地移除并用细镊子拉扯
    6. 转移视网膜在35 mm皿中装有DPBS。使用精细的手术刀，切片的视网膜小片（2mm）以帮助解离。视网膜的数量解剖取决于你的需要。通常，对于一个E17视网膜，产量为约0.5×10 6个细胞，对于一个P0视网膜，产量为1.6×10 6个细胞。它是最佳解剖至少6至8视网膜，因为它提高细胞恢复
  图1.视网膜解剖。步骤1至5显示了从视网膜解剖视网膜的程序。步骤6显示解剖的视网膜和晶状体
3. 视网膜的解离（所有这些步骤在层流罩中进行）
  1. 组织消化
    从水浴中取出木瓜蛋白酶管，加入2mg L-半胱氨酸。
    转移在这个管中的视网膜的片段。
    将管在37°C水浴中，孵育5分钟，如果你是使用E17视网膜或8分钟，如果你正在使用P0视网膜。
  2. 酶活性的中和
    从水浴中取出管，让视网膜片块沉降在管的底部并用温和的去除上清液吸气。
    在视网膜上慢慢加入4 ml LO-OVO溶液。
    让视网膜的片段在管的底部沉降并移除轻柔吸出上清液。加入1ml LO-OVO溶液
  3. 研磨
    使用P1000，轻轻地研磨上下视网膜碎片，将它们分开，直到溶液显示混浊。
    确保细胞悬浮液很好地解离，没有通过观察悬浮液的小等分试样残留细胞团块在显微镜下如果观察到结块，则研磨悬浮液用更多的力直到单细胞悬浮液获得。（如果细胞难以解离，孵育时间在木瓜蛋白酶中可以增加）。小心不要过度磨损细胞，这可能会导致生存率下降。
    添加剩余将5ml LO-OVO溶液加入细胞悬浮液中并离心11分钟室温下在200×g下进行台式离心机。
4. 电镀
  1. 从培养箱中取出RGM培养基。
  2. 吸出上清液，轻轻地重悬细胞沉淀在1ml平衡的RGM培养基中
  3. 使用血细胞计数器，计数总细胞数。对于克隆密度培养，每35mm培养皿加入5,000个细胞，用于低密度培养培养，每35mm培养皿添加20,000个细胞并用于高密度培养，每35mm培养皿加入100,000个细胞。
  4. 在1ml RGM培养基中稀释至正确量的细胞，并将其加至35mm培养皿中。
  5. 置于37℃，8％CO 2的培养箱中2小时。
  6. 一旦细胞粘附在培养皿的底部，轻轻加入另外1.5毫升培养基并在培养箱中更换。
5. 喂食
  通过去除50％的培养基并加入相同量的平衡的RGM培养基，每3至4天饲喂细胞。在最佳条件下，细胞可培养10至14天

培养细胞的免疫染色
注意：在这些培养条件下，视网膜祖细胞将分裂并分化成不同的视网膜细胞类型，通常由E17产生（阿米库林，双极杆，杆状光感受器和穆勒细胞）。各种细胞特异性标记可用于鉴定不同的视网膜细胞类型。视网膜祖细胞的巢蛋白，神经节细胞的Brn3b和神经膜165，杆感光细胞的视紫红质和恢复蛋白，双极细胞的Islet-1和半胱氨酸和神经节细胞的亚型，而Pax-6是视网膜祖细胞，神经节细胞。在这里，我们提供了免疫染色的一般方案。
1. 吸出培养基并通过加入冷的4％PFA固定细胞在冰上15分钟
2. 用1x PBS冲洗三次。
3. 在室温（RT）下用封闭/透化溶液（20％山羊血清+ 0.4％Triton在1x PBS中）封闭/透化1小时。
4. 准备一抗在1毫升的块/透化溶液。稀释度取决于抗体。
5. 在4℃孵育过夜。
6. 丢弃一抗。
7. 用1x PBS冲洗三次。
8. 准备第二抗体在1ml的阻断/透化溶液中。二抗通常以1:1000稀释度使用。
9. 在室温下孵育1小时。
10. 丢弃二抗。
11. 用1x PBS冲洗三次。
12. 为了复染核，在室温下在Hoechst溶液（1ml Hoechst在10ml 1×PBS中）孵育5分钟。
13. 在倒置显微镜下观察。
  
  图2.解离培养物的相差显微镜和免疫染色显微照片。A.两个视网膜祖细胞在铺板后18小时。视网膜祖细胞具有典型的双极形态。 B.在培养7天后观察到的解离的视网膜细胞培养物，显示许多分化的神经元。 C.电镀后24小时，视网膜祖细胞对巢蛋白（红色）染色

食谱

生长因子
1. b-FGF：在10mM Tris pH8.5中重构至100μg/ml的浓度
2. EGF：在水中重构至250μg/ml的浓度
3. NT-3：在水中重构至浓度为100μg/ml
4. BDNF：稀释1mg/ml储备溶液至50μg/ml的浓度在水中
10x Lo类粘蛋白
向40ml DPBS中加入600mg BSA，混匀
加入600mg胰蛋白酶抑制剂并混合溶解
调节pH至7.4; 需要添加约。 400μl1N NaOH
当完全溶解时，通过用PBS预漂洗的0.22μm过滤器过滤制成1.0毫升等分试样并储存在-20℃下
20x 4％BSA
在50ml DPBS中加入2μgBSA
在37℃溶解将pH调节至7.4（使用约200μl1N NaOH）
依次通过0.45μm和0.22μm过滤器，用PBS预漂洗
使1.0 ml等分
储存于-20°C
0.4％DNase
将40mg溶于10ml无菌水中
通过轻微反转混合
等分于200μl，储存于-20°C
胰岛素（2.5mg/ml）
向10ml无菌水中加入
25 mg胰岛素
50μl1.0 N HCl
混合良好
在4°C下储存不超过4至6周
cpt-cAMP（50mM）将cpt-cAMP溶解在无菌水中，浓度为25mg/ml 等分于200μl，储存于-20°C
NAC（6mg/ml）将6mg N-乙酰半胱氨酸溶解在1ml Neurobasal培养基中
等分于200μl
储存于-20°C
毛喉素（10mM）
将2.4ml DMSO加入到10mg瓶（4.2mg/ml或10mM）中使50微升等分
储存-20°C
N2补充
1. 准备N2储备溶液
  1. 载脂转铁蛋白：将500mg溶于5ml水（100mg/ml储备溶液）中，过滤（0.22μM），等分并保存在-20℃下。
  2. 孕酮：将6mg溶于10ml乙醇中，制成0.6mg/ml 储备溶液，过滤器（0.22μM），等分并保存在-20℃下
  3. 腐胺：将1.6g溶于10ml水中，制成1M（160mg/ml）储液，过滤器（0.22μM），等分并保存在-20℃下
  4. 亚硒酸钠：将2.59mg溶于5ml水中，制成3mM原液解决方案，过滤器（0.22μM），等分并保存在-20℃下
  5. BSA：将500mg溶解在10ml水中以制备50mg/ml储备溶液，过滤& （0.22μM），等分并保存在-20℃
2. 准备10ml的100×N 2溶液
  向7.857ml DMEM-F12中加入以下物质：
  1 ml 的转铁蛋白100mg/ml
  33μl的孕酮0.6mg/ml
  100μl腐胺1MW / 10μl亚硒酸钠3mM
  1ml BSA 50mg/ml
  在200μl等分试样并储存在-20℃&
4％多聚甲醛
稀释一小瓶16％PFA（10ml）在26ml水+ 4ml 10x PBS中; 此溶液可在4℃保存不超过1个月。

致谢

这项工作的资金由加拿大卫生研究院和加拿大基金会战斗盲人提供。该方案改编自Cayouette等人（2003）中公开的程序。作者希望感谢Cayouette实验室的成员，过去和现在，多年来对协议的持续支持和改进。

参考文献

Cayouette，M.，Barres，B.A。和Raff，M。（2003）。发育中的大鼠视网膜中细胞命运决定的内在机制的重要性。 Neuron 40（5）：897-904。
Jensen，A.M。和Raff，M.C。（1997）。在克隆密度培养中连续观察多潜能视网膜祖细胞。 188（2）：267-279。