材料和试剂

动物
我们通常使用来自白化Sprague Dawley大鼠或小鼠的视网膜。外植体可以从在胚胎第12天到产后第4天之间的动物制备
DPBS（Life Technologies，目录号：14040）
DMEM（Life Technologies，目录号：10569-010）
胎牛血清（FBS）（Wisent，目录号：080-450）
青霉素/链霉素（Life Technologies，目录号：15070）
70％乙醇
Fungizone antimycotic（Life Technologies，目录号：15290026）
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：SO389）
O.C.T. 化合物（Somagen，目录号：4583）
外植体介质
4％Paraformadehyde（PFA）溶液（Electron Microscopy Sciences，目录号：15710）（参见配方）
20％蔗糖/OCT（1：1）（参见配方）
20％蔗糖溶液（见配方）

设备

Millicell器官插入物（EMD Millipore，目录号：PICMORG50）
35mm皿或6孔板
37℃和5％CO 2培养箱
100毫米培养皿
150 mm皿
直线力
FIne forcep（Fine Science Tools，目录号：11252-23）
弯曲力（Fine Science Tools，目录号：91197-00）
锋利的剪刀
Sharp scapel（Fine Science Tools，目录号：10315-12）
剃刀刀片
P1000移液器
CO 2室
Cryomold 15×15×5mm（VWR International，目录号：CA60872-016）

程序

实验日

准备外植体培养基（参见制备储备溶液的配方）
1. 外植体介质
  在50ml试管中，加入：45ml DMEM
  5ml胎牛血清（FBS）
  500μl的pen/strep 100x
  50μlFungizone antimycotic
  为了在适当的温度和pH下平衡培养基，将盖子放在50ml管上并旋开¼圈。将管置于37℃和5％CO 2的培养箱中直至需要
培养板的制备
1. 外植体在Millicell器官型插入物上培养。我们通常使用35mm皿或6孔板将插入物放入。
2. 填充菜（或井）与1.2毫升平衡的外植体培养基和用无菌镊子将插入物轻轻地放置在其上。
3. 放置菜（或板）在37℃和5％CO 2培养箱中培养直至需要。
视网膜解剖
注意：解剖应在无菌条件下进行。用70％乙醇喷洒工作区域并使用火焰。在使用前消毒所有仪器。
准备两个100毫米的菜充满了10毫升的无菌DPBS，一个转移头和其他解剖的眼睛和两个35毫米的菜，填充2毫升无菌DPBS收集视网膜。
1. 胚胎的集合
  1. 在CO 2室中对动物安乐死。
  2. 将动物放在其背部，用70％乙醇清洁腹部。
  3. 捏直皮肤与直的forcep，抬起皮肤和肌肉和做一个V形开口使用剪刀在腹部的两边，从下腹部开始并在侧面切割一直的动物。抬起皮肤和肌肉向上，揭示内部器官和子宫。
  4. 切出子宫并将其转移到150mm的皿中。
  5. 从子宫中取出胚胎，用锋利的剪刀摘下头。
  6. 将头转移到填充有DPBS的100mm皿中。
2. 视网膜的解剖
  1. 小心去除覆盖眼睛的皮肤。
  2. 放置一个弯曲的forcep的两侧的眼睛，并施加温和的压力。眼睛应该小狗。
  3. 捏紧眼睛的后面，拉。
  4. 将眼睛转移到填充有DPBS的100mm皿中。
    1. 使镜片面朝下，用细镊子将眼睛固定在适当位置，并去除视神经（图1，步骤1-2）。
    2. 通过视神经头引入另一镊子的尖端在脉络膜和视网膜之间以固定巩膜。
    3. 现在巩膜是固定的，你需要轻轻地撕开它与两者打开镊子从视神经头到角膜以暴露视网膜透镜（图1，步骤3-4）。
    4. 小心地取下镜片，将视网膜放在装有DPBS的35 mm培养皿中（图1，步骤5-6）。
    5. 从E18-19起，需要去除血管覆盖视网膜以避免内皮细胞污染文化。
    6. 血管形成上覆的微红色膜视网膜的内表面。膜很容易被去除捏和拉用精细钳子。
    7. 将视网膜转移到填充有DPBS的35mm皿中。
  图1.视网膜解剖的程序。步骤1-5显示从视网膜解剖视网膜的程序。步骤6显示从镜片分离的解剖的视网膜
外植体的制备
1. 对于早于胚胎第15天的视网膜，切割约5mm的小块（图2，步骤1-2）。对于年轻的视网膜，将整个视网膜放置在插入物上。
2. 用剃刀刀片，切开P1000移液器吸头的边缘，做一个更大的开口。转移外植体从35毫米的菜到插入。外植体的哪一侧面向上是无关紧要的插入。轻轻放置外植体尽可能平坦（图2，步骤3）。尽量不要折叠或撕裂外植体，因为这可能导致层的形成缺陷，使分析困难。
3. 将培养皿置于37℃和5％CO 2的培养箱中。应该留下培养物直到视网膜完全发育（在产后14天内在体内）。对于在胚胎第13天开始的外植体，这意味着培养20天。对于在出生后第0天开始的外植体，这意味着培养14天
4. 每3天更换一次培养基，更换80％的培养基
  
  图2.外植体的制备从整个视网膜（步骤1）开始，切割小块（步骤2），并置于器官型过滤器上（步骤3）。
固定外植体
1. 在所需的培养期后，从盘中取出插入物并抽吸培养基。
2. 更换为新鲜4％PFA。将插入物放回盘中。轻轻加入1毫升的4％PFA在插入物的顶部。 PFA溶液需要在室温下以帮助维持外植体形态。
3. 孵育30分钟。用PBS轻轻冲洗3次。
制备用于冷冻切片的外植体
1. 用20％蔗糖溶液替换PBS。确保外植体覆盖良好。在4℃孵育过夜。
2. 对于冷冻保护，用20％蔗糖/OCT（1：1）的混合物填充小的冷冻切片。
3. 从插入物的顶部移除20％蔗糖溶液，从盘中取出插入物，并使用锋利的scapel，切割每个外植体周围的膜。
4. 用细镊子挑取一块膜/外植体，并将其放在冷冻切片中。轻轻地推下外植体，并将它们放在冷冻切片的底部。
5. 确保它覆盖了足够的20％蔗糖/OCT解决方案。
6. 在液氮中快速冷冻（不要将冷冻切片浸入液氮中，只要接触模具底部的氮气表面），并储存在-80°C直到准备切片。
7. 根据所需分析的类型，截面厚度可在10和30μm之间变化。
  
  图3.培养14天后在10×（A）或40×放大倍率下的视网膜外植体冷冻切片的显微照片。用Hoechst对视网膜进行复染以显现细胞核。识别视网膜层，ONL：外核层，INL：内核层

食谱

4％多聚甲醛
10ml 16％多聚甲醛
26ml去离子水
4ml 10×PBS（pH7.4）
20％蔗糖将20g蔗糖溶于80ml 1×PBS（pH7.4）中
一旦溶解，用1×PBS（pH7.4）将体积补至100ml，
20％蔗糖/0.C.T。（1：1）
20ml 20％蔗糖溶液 20ml O.C.T。化合物
彻底混合

致谢

这项工作的资金由加拿大卫生研究院和加拿大基金会战斗盲人提供。该方案改编自Kechad等人（2012）和Elliott等人（2008）中公开的程序。作者希望感谢Cayouette实验室的成员，过去和现在，多年来对协议的持续支持和改进。

参考文献

Cayouette，M.，Barres，B.A。和Raff，M。（2003）。发育中的大鼠视网膜中细胞命运决定的内在机制的重要性。 Neuron 40（5）：897-904。
Cayouette，M。和Raff，M。（2003）。细胞分裂的方向影响发育中的哺乳动物视网膜中的细胞命运选择。 em> Development 130（11）：2329-2339。
Elliott，J.，Jolicoeur，C.，Ramamurthy，V。和Cayouette，M。（2008）。 Ikaros赋予小鼠视网膜祖细胞早期时间能力。 Neuron em> 60（1）：26-39。
Kechad，A.，Jolicoeur，C.，Tufford，A.，Mattar，P.，Chow，R.W.，Harris，W.A。和Cayouette，M。（2012）。 Numb是在发育的小鼠视网膜中产生末端不对称细胞分裂所需的。 a> J Neurosci 32（48）：17197-17210。