材料和试剂

从小鼠骨髓分离的多能基质细胞（MSC）[参见方案"多能性基质的分离来自小鼠骨髓的细胞"（Tormo等人，2014）]
Dulbecco's Modified Eagle's Medium具有稳定的L-谷氨酰胺（DMEM）的高葡萄糖（Wisent，目录号：319-015-CL）
青霉素/链霉素溶液（Wisent，目录号：450-201-EL）
胎牛血清（FBS）（Life Technologies，Gibco ，目录号：12483）
0.53mM 0.05％胰蛋白酶/EDTA（Wisent，目录号：325-042-EL）
没有Ca 2+和Mg 2+ 2 + （Wisent，目录号：311-01-CL）的PBS;
HEPES（Wisent，目录号：330-050-EL）
10nM地塞米松（Sigma-Aldrich，目录号：D4902）
50μM抗坏血酸-2磷酸盐（维生素C）（Sigma-Aldrich，目录号：A4403）
50nM胆钙化醇（维生素D3）（Sigma-Aldrich，目录号：C9756）
10mM B-磷酸甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G9891）
100x蛋白酶和磷酸酶抑制剂（Thermo Fisher Scientific，Pierce，目录号：PI78447）
IL-27（1μg）（R& D Systems，目录号：2799-ML-010/CF）或任何待测试的重组蛋白质
二辛可宁酸测定（BCA）（Thermo Fisher Scientific，Pierce，目录号：PI23225）
蒸馏水
乙醇
抗IL-27 p28生物素化抗体（R& D Systems，目录号：BAF1834）或对于待测蛋白特异的生物素化抗体
链霉亲和素-HRP（Thermo Fisher Scientific，Pierce，目录号：PI21130）
不含溴酚蓝或DTT的SDS-PAGE上样缓冲液
尿素缓冲液（Fisher Scientific，目录号：BP169-10）
1 M磷酸二氢钠（Fisher Scientific，目录号：BP330-1）
1M磷酸氢二钠（Fisher Scientific，目录号：BP332-1）
TBS-Tween
3％BSA
地塞米松溶液（参见配方）
10x甘油磷酸盐溶液（见配方）
1,000x维生素C溶液（见配方）
成骨分化培养基（50ml）（参见配方）
茜素红S（Sigma-Aldrich，目录号：A5533）（参见Recipes）
尿素/磷酸盐裂解缓冲液（见配方）

设备

15 ml管
离心机用于细胞培养
6孔组织培养板（BD Biosciences，目录号：DL-353046）
具有平底的96孔组织培养板（BD Biosciences，目录号：DL-353072）
反相相差显微镜
37℃，5％CO 2细胞培养箱中培养
细胞刮刀（Corning，目录号：3010）
BCA（562 nm）微孔板读数器
SDS-PAGE设备
Western印迹设备

程序

MSC用2ml PBS轻轻冲洗一次并用胰蛋白酶消化。对于细胞胰蛋白酶化：在漂洗的细胞上加入0.5ml胰蛋白酶。等待3到5分钟，直到细胞从塑料表面剥离。转移细胞在15毫升管，并迅速加入10毫升含10％FBS的DMEM，以抑制胰蛋白酶作用。
细胞在4℃以435×g离心5分钟沉淀
除去上清液，将细胞在6孔板中以5,000-10,000个细胞/孔的密度在2ml补充有10％FBS的DMEM中孵育。
将细胞在5％CO 2培养箱中在37℃温育过夜
通过在没有任何搅拌的情况下每孔轻轻地添加和移除2ml PBS，用PBS洗涤MSC两次。在洗涤后细胞必须仍然粘附到孔的底部。然后将贴壁细胞与成骨分化培养基一起温育
成骨分化培养基每2天更换10天
在第10天，用PBS洗涤分化的细胞，并在室温下暴露于茜素红S制剂5分钟，无任何搅拌。
用蒸馏水冲洗细胞，通过显微镜检查评估表明成骨分化的红色（参见图1）。

图1.多潜能基质细胞分化成骨细胞10天。通过茜素红S染色检测骨形态分化（Tormo等人，2013）。（版权所有2013年。美国免疫学家协会）
将每个孔与500μl无血清DMEM中的1μgIL-27（或其他待测分子）一起在冰上孵育1小时，无需搅拌（确认所有孔通过培养基回收）。单独的DMEM用作阴性对照
将细胞用1ml冰冷的无血清DMEM洗涤5次，无需搅动，并在100μl添加了蛋白酶和磷酸酶抑制剂的尿素/磷酸盐裂解缓冲液中刮取。
将裂解物转移到1.5ml管中，用不含溴酚蓝和无DTT的SDS-PAGE上样缓冲液稀释10倍。
使用BCA试剂盒（遵循制造商方案）定量蛋白质浓度，通过SDS-PAGE（在每管加入5％b-巯基乙醇后）和Western印迹分析50μg总蛋白。
在室温下在含有3％BSA的TBS-Tween中封闭Western印迹膜30分钟，随后用生物素化的山羊抗小鼠p28Ab（在4℃孵育过夜）和HRP标记的链霉亲和素（在室温下温育1小时）。所有孵育在含有3％BSA的TBS-Tween中进行。在与Ab或链霉亲和素孵育后进行洗涤。这些膜洗涤由在室温下在20ml TBS-Tween中在搅拌下孵育10分钟组成。

食谱

1,000x地塞米松溶液
将1.2mg地塞米松溶解在1,223μl乙醇中将10μl的该2.5×10 -3 M溶液转移到2.5ml DMEM中此解决方案现在为1x10 ^-5 M（1,000x）
10x甘油磷酸盐溶液
将630mg b-甘油磷酸溶解在20ml DMEM/15mM HEPES（pH7.5）中在组织培养罩下通过0.22μm孔径的膜过滤
1,000x维生素C溶液
将50mg维生素C溶解在10ml DMEM/15mM HEPES（pH7.5）中在组织培养罩下通过0.22μm孔径的膜过滤
成骨分化培养基（50ml）
5微升地塞米松0.5mM（1,000x）
1ml 500mg/ml的甘油磷酸盐 50μl50 mM维生素C（1,000x）
50微升维生素D3 50微升
5ml FBS
用DMEM完成至50ml
茜素红S制剂
具有2％茜素红S的磷酸盐缓冲盐水（PBS）
（8M）尿素/磷酸盐400mM裂解缓冲液（pH7.5）（100ml）将77.4ml 1M Na 2 HPO 4与22.6ml 1M NaH 2 PO 4溶液混合，得到 100ml的1M磷酸盐缓冲液（pH7.5）将48g尿素与40ml 1M磷酸盐缓冲液（pH7.5）混合用Na 2 HPO 4水溶液将pH调节至7.5 将dH <2> O添加到100 ml
注意：在使用前加入1x磷酸酶和蛋白酶抑制剂（在所需体积的尿素/磷酸盐溶液中稀释1/100以获得1x最终浓度）。

致谢

该协议改编自Tormo等人（2013）。

参考文献

Tormo，A.J.，Beaupre，L.A.，Elson，G.，Crabe，S.and Gauchat，J.F。（2013）。聚谷氨酸模体赋予IL-27羟基磷灰石和骨结合特性。 J Immunol 190（6）：2931-2937。
Tormo，A.J.，Rafei，M。和Gauchat，J.F。（2014）。从小鼠骨髓中分离多潜能基质细胞生物协议 4 （4）：e1031