材料和试剂

COS-7细胞（ATCC，目录号：CRL-1651 ）
编码感兴趣的膜蛋白的哺乳动物表达质粒
编码与Fc部分融合的胞外蛋白的质粒人IgG [例如，InvivoGen的pFUSE系列和Eshed等人（2005）的pSXFc是用于克隆载体以制备该融合构建体的选择]
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM），高葡萄糖，无谷氨酰胺（Life Technologies，目录号：11960-044）
胎牛血清III血清（Thermo Fisher Scientific，目录号：SH30109.03）
100x GlutaMAX-I（Life Technologies，目录号：35050-061）
Lipofectamine 2000（Life Technologies，目录号：11668-019）
Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS）（无钙，无镁）（Life Technologies，目录号：14190-144）
病毒产生无血清培养基（VP-SFM）（Life Technologies，目录号：11681-020）
4-（2-羟乙基）哌嗪-1-乙磺酸（HEPES）（Sigma-Aldrich，目录号：H4034）
蛋白质浓缩器（9K MWCO，7ml）（Thermo Fisher Scientific，目录号：87748）
山羊抗人IgG，Fcγ片段特异性，与荧光团缀合（例如Jackson ImmunoResearch Laboratories，目录号：109-545-098用于荧光素，109-585-098用于德克萨斯红） >
COS-7培养基（见配方）
0.2 M PB（参见配方）
4％PFA（参见配方）
PBS（请参阅配方）

设备

6孔细胞培养板（Corning Incorporated，目录号：3516）
玻璃盖玻片（VWR International，目录号：48366-227）
10厘米平皿
离心机
37℃/5％CO 2细胞培养孵化器
普通荧光显微镜

程序

含有细胞外蛋白质的培养基的生产。
1. 种子COS-7细胞在10厘米的培养皿
2. 用编码与人IgG Fc融合的细胞外蛋白质的质粒（我们使用Lipofectamine 2000：1μgDNA +2μlLipofectamine 2000用于6孔板中的一个孔，并根据制造商的说明书）转染细胞。 br />
3. 转染后一天，除去所有培养基，用6ml DPBS洗涤培养物两次，加入10ml含2×GlutaMAX-I的VP-SFM。
4. 两天后，收集所有培养基，并向培养物中加入10ml新鲜的VP-SFM/2x GlutaMAX-I。
5. 在3,000×g离心收获的培养基3分钟，收集上清液，通过加入终浓度10mM HEPES-Na + pH 8.0中和它。 >
6. 重复步骤1d和1e。
7. 池两批培养基，用蛋白浓缩器浓缩至原体积的1/10倍。浓缩培养基可以储存在-80℃（我们通常以1ml等分试样存储浓缩培养基。对于我们的融合蛋白，即使在5次冻融循环后，结合活性仍然良好，如果冷冻和解冻是关注的，建议首先测试未冻结制剂的结合活性）。
种COS-7细胞直接进入含有玻璃盖玻片（不需要处理）的6孔板和培养基。
用编码膜蛋白的质粒转染细胞
两天后，解冻来自步骤1的含有Fc融合蛋白的浓缩培养基
对于一个盖玻片上的结合测定，取100μl的浓缩培养基，并加入与荧光团缀合的山羊抗人Fc抗体，终浓度为7.5ng/ml。在冰上孵育30分钟（用箔覆盖，以保护荧光团免受光照）。
转移盖玻片从细胞从原始的6孔板到新的空6孔板，并将步骤5的混合物小心地加到盖玻片上（100μl混合物停留在盖玻片的顶部）。在室温下孵育30分钟（用铝箔覆盖）。
除去浓缩培养基和山羊抗人Fc抗体的混合物，并用2ml冰冷的DPBS冲洗三次。
将细胞固定在盖玻片上，并按照常规免疫染色程序。固定和染色条件取决于一抗和二抗的性质。对于我们的大多数抗体，进行以下程序：（对于整个程序避光）。
1. 每孔加入2ml冰冷的4％PFA，并在4℃下孵育20分钟
2. 用2ml室温PBS冲洗三次。
3. 盖玻片上的细胞准备好阻断/透化和免疫染色以显现膜蛋白的表达。
图1.结合测定的实例。用表达NF186的质粒转染COS-7细胞，然后与山羊抗人Fc抗体混合物一起温育，含有Fc或BcG3-Fc的浓缩培养基。通过Hoechst显现细胞核。 Fc不与NF186相互作用并且是阴性对照。 BcG3-Fc与NF186特异性相互作用，不与未转染的细胞结合。比例尺= 16μm。

食谱

COS-7培养基（100ml） 89 ml DMEM
10ml胎牛血清III / 1ml的100×GlutaMAX-I / 储存在4°C
0.2 M PB（1L）
在900ml ddH 2中溶解4.56g的NaH 2 PO 4和23.004g的Na 2 HPO 4， sub> 2 O，并调整到1000毫升
在室温下贮存
4％PFA（100ml）通过加入几滴10N NaOH将4g多聚甲醛溶解在50ml 50-60℃ddH 2 O中。
加入50ml 0.2M PB
加入浓HCl，调节pH至7.2-7.4 如果存储在4°C，则有效期为2天
PBS
150mM NaCl 10.4mM磷酸钠（pH7.2）

致谢

该方案改编自Eshed等（2005）和Susuki等人（2013）。

参考文献

Eshed，Y.，Feinberg，K.，Poliak，S.，Sabanay，H.，Sarig-Nadir，O.，Spiegel，I.，Bermingham Jr，JR和Peles，E。（2005） http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16039564"target ="_ blank"> Gliomedin介导施万细胞轴突相互作用和Ranvier的淋巴结的分子组装。 Neuron 47（2）：215-229。
Susishi，K.，Chang，K.-J.，Zollinger，DR，Liu，Y.，Ogawa，Y.，Eshed-Eisenbach，Y.，Dours-Zimmermann，MT，Oses-Prieto，JA，Burlingame， Seidenbecher，CI（2013）。三种机制组装了ranvier的中枢神经系统节点。神经元 78（3）：469-482。