材料和试剂

在温室中生长的2至4周龄豆类植物的上叶
质粒DNA 2-4微克
将2.5M CaCl 2（Sigma-Aldrich，目录号：C3306-500G）（任选的其它氯化物，例如ZnCl 2，MgCl 2 可用于需要避免钙离子的情况）
0.1mM亚精胺（Sigma-Aldrich，目录号：S0266-1G）
75％，96％和100％乙醇
无菌miliQ水
1 M亚精胺储备溶液（见配方）
0.1 mM亚精胺工作溶液（见配方）

设备

微量离心机（Eppendorf MiniSpin）
破裂盘1,100psi（Bio-Rad Laboratories，目录号：165-2329）（可选择形式为450至2,000psi）
微载体：Tungsten M17（Bio-Rad Laboratories，目录号：165-2267）
大载体（Bio-Rad Laboratories，目录号：165-2257）
停止屏幕（Bio-Rad Laboratories，目录号：165-2336）
真空泵（Bio-Rad Laboratories）（根据Bio-Rad技术推荐）
涡流
镊子
1.5ml微量离心管（Eppendorf）
parafilm
培养皿底部有湿滤纸
Biolistic PDS-1000/He颗粒递送系统（Bio-Rad Laboratories; www.bio-rad.com ）
立体显微镜（尼康公司，型号：SMZ 1500）与外荧光设备（可选）

程序

微载体等分试样制备
1. 称量50mg钨到1.5ml微量离心管中注意：直径1.1μm的钨颗粒容易粘到塑料上。我们建议将钨直接放入微量盖，先前从管中切出，以避免浪费金属粉末。
2. 对于钨的表面灭菌，加入1ml 96％乙醇并剧烈涡旋2分钟，并在微量离心机中旋转5秒。
3. 弃去乙醇，并在1ml miliQ水中重悬钨颗粒
4. 大力涡旋并在微量离心机中旋转5秒
5. 弃去水，并重复用水洗涤三次。
6. 加入1毫升水，准备50微升等分试样; 在等分期间连续涡旋对于维持均匀取样是必要的。等分试样可储存于-20°C
用质粒DNA包被钨颗粒
1. 微载体应在计划轰击当天用DNA包被。对于两次注射（每次10μl），在1.5ml微量离心管中制备以下混合物：
  注意：建议在整个过程中连续旋转混合物以使质粒DNA均匀沉淀到钨颗粒上。
2. 通过在微量离心机中旋转2秒来沉淀微载体
3. 弃去上清液，用50μl75％乙醇洗涤钨，短暂旋转后，除去上清液，并用100％乙醇重复洗涤两次。每次洗涤步骤后在微量离心机中旋转5秒
4. 加入二十微升100％乙醇，并通过涡旋和移液分散聚集体。如果仍然可以看见大的聚集体，则对样品进行超声处理注意：大的聚集体在轰击期间可能会对植物组织造成严重损害，从而显着降低转染率。
大载体根据制造商的方案制备，有用的链接：
http://www.bio-rad.com/webroot /web/pdf/lsr/literature/Bulletin_9075.pdf
1. 使用镊子将macrocarrier放在macrocarrier持有人内。大载波的边缘应该被牢固地放置在大载波载体的底部。正确插入时，它不会伸出，并在支架底部形成平坦表面。
2. 加载10微升载体上载有微载体的微载体（图1A）。尝试通过使用移液管尖端通过宏载体表面的中心扩散它们。避免钨颗粒聚集在一个地方。
3. 让乙醇蒸发，在干燥的地方留下10分钟的macrocarries
  
  图1。 A.涂有微载体（箭头）的大载体，插入大载体支架中。 B.停止屏幕（箭头）放置在固定的宏载体发射组件的下一个。 C.倒置的巨载体支架（箭头），干燥的微载体面朝下，在宏载体发射组件的固定下面。 D.将大载体盖子盖（箭头）放置到组装的固定座上。
轰击
1. 在微轰击之前切叶，并将它们放置在培养皿中，其中轴侧暴露用于轰击。
  根据制造商的协议进行轰击，有用的链接：
  http://www.bio-rad.com/webroot /web/pdf/lsr/literature/Bulletin_9075.pdf
2. 打开生物弹道装置，真空泵，用主阀打开氦气箱，用调节器将压力设置为在所选破裂盘爆破压力（使用1,100psi破裂盘设置为1,300-1,400psi）下为200dpi。
3. 使用镊子将破裂盘装入保持杯;带有破裂盘的螺旋保持杯安装到气体加速管上，使用从左到右的运动。必须充分拧紧;否则当气体加速管充满氦气时，破裂盘可能会滑出。
4. 将大载体支架和停止屏幕装载到宏载体发射组件（图1B，1C，1D）
5. 将宏载体发射组件放入轰击室，设置破裂保持杯之间的距离间隙（图2，我们通常将其放置在距离顶部第二个位置）并关闭门。
6. 将打开的带植物样品的培养皿放在从样品室底部插入第二位置的目标架上（图2）。
  
  图2.装有植物样品的PDS/He单元的前视图
7. 保持真空在所需的水平（最低5英寸汞柱，我们设置在27.5）
8. Bombard样品：按下火按钮，直到爆破片爆裂，然后释放火按钮
9. 释放样品室的真空。
10. 从室中取出植物样品。
11. 卸载宏载体启动组件和破裂盘保持杯。
12. 关闭氦气箱上的主阀，从系统中取出氦气：将真空度设定在5英寸汞柱，按住灭火按钮，直到氦气调节器中的氦气压力达到0级。
13. 关闭生物弹道装置和真空泵
14. 轰击后将叶子放在培养皿中的湿滤纸上并用石蜡膜密封。保持在黑暗的地方在室温下约ca. 18小时。通常90-100％的转染细胞显示两种荧光团的荧光。建议首先在荧光立体显微镜下检查组织，以切出具有最高密度的转染细胞的叶片段。

食谱

在miliQ水中制备1M亚精胺储备溶液。通过0.22μm注射器式过滤器过滤灭菌溶液， -80℃。
通过用无菌miliQ水稀释1M储备液制备0.1mM亚精胺工作溶液。准备100微升的等分试样，并将其存储在-20°C长达1年

致谢

该协议基于Giska等人（2013）描述的程序。

参考文献

Giska，F.，Lichocka，M.，Piechocki，M.，Dadlez，M.，Schmelzer，E.，Hennig，J.and Krzymowska，M。（2013）。 HopQ1的磷酸化，一种来自丁香假单胞菌的III型效应物，创造了一种主机14-3-3蛋白的结合位点。植物生理学 161（4）：2049-2061。
Sudowe，S。和Reske-Kunz，A.B。（2013年）。生物体DNA递送方法和方案方法 Mol Biol Vol 940.
Ueki，S.，Lacroix，B.，Krichevsky，A.，Lazarowitz，S.G.and Citovsky，V。（2009）。通过生物射弹轰击拟南芥叶片的功能性瞬时遗传转化。 4（1）：71-77。