材料和试剂

A549细胞（美国典型培养物保藏中心）
人表皮生长因子（EGF）（Sigma Chemical，目录号：E9644）
100x胰岛素转铁蛋白硒（ITS）（Life Technologies，目录号：41400-045）
Rosewell Park Memorial Institute（RPMI）Medium-1640（ATCC，目录号：41400-045）
50μM氢化可的松（Sigma-Aldrich，目录号：H6909）
牛血清白蛋白（BSA）（US Biochem，目录号：10857）
一次性无菌组织培养过滤器（Corning，目录号：431161）
胆碱/乙酰胆碱定量试剂盒（BioVision，目录号：K615-100）
液氮
无血清RPMI（SF-RPMI）（参见配方）
炔雌醇（Sigma Chemical，目录号：N2001）（参见Recipes）

设备

60mm细胞培养皿（Corning，目录号：353002）
微杯管
ELISA读数器
冻干机（Labonco）
离心机
CO 2细胞培养孵化器
-80°C冰箱

程序

将A549细胞在设定为5％CO 2和37℃的细胞培养箱中在60mm细胞培养皿中在5ml无血清RPMI（SF-RPMI）中生长至90％-95％汇合（Lau等人，2013; Song等人，2008; Song等人，2003）。
在测定当天，在37℃下将100μM新斯的明（细胞中的AChE的化学抑制剂）加入每个板中4小时。该板含有3ml培养基。请参见注释部分关于新斯的明浓度的优化
加入新斯的明4小时后，加入相应浓度的测试化合物（其促进/抑制ACh的分泌），并将细胞在37℃下孵育36小时。促进ACh产生的化合物的实例是100nM尼古丁。
收集上清液（培养基）并以800×g离心
将上清液在-80℃冷冻，然后冻干。将冻干机设定为10微米Hg的压力或低于该值。将样品冻干过夜。
随后，将冻干物用1/5体积的高压灭菌水（600μl高压灭菌水）重构，在液氮中快速冷冻并储存在-80℃直至进一步分析。
使用胆碱/乙酰胆碱定量试剂盒，根据制造商的说明书测量样品中的ACh的量（ http://www.biovision.com/choline-acetylcholine-quantification-colorimetric-fluorometric-kit-2910.html ）。测定试剂盒中概述的方案将附于此处。每个样品一式三份进行测定

笔记

ACh由肺癌细胞分泌到细胞外环境中。部分ACh与同样的肺癌细胞上的烟碱乙酰胆碱受体和毒蕈碱乙酰胆碱受体结合，以自分泌方式刺激它们的增殖。过量的ACh被酶AChE快速降解以产生胆碱，然后细胞吸收所述胆碱以合成新的ACh。因此，必须抑制AChE以测量肺癌细胞产生的ACh 新斯的明浓度的优化：

加入新斯的明以抑制细胞中的酶AChE。重要的是滴定要使用的新斯的明的量，否则其可能损害测定的读出。
A549细胞在设定为5％CO 2的细胞培养箱中在60mm细胞培养皿中在无血清RPMI（SF-RPMI）中生长至90％-95％汇合。和37℃。
在测定当天，加入以下浓度的新斯的明
1. 10μM
2. 20μM
3. 50μM
4. 100μM
5. 200μM
6. 300μM
每个平板含有3ml培养基。将细胞在37℃孵育36小时。
按照上述步骤的步骤4-7。
在我们的实验中，ACh的产生随新斯的明浓度的增加而变化，如图1A所示。图1B显示所有三种细胞系中的AChE量相似。在100-200uM新斯的明存在下，ACh的基线量最高。因此，我们选择100 uM新斯的明用于所有我们的实验。可能300uM的新斯的明是有毒的，所以细胞和引起细胞死亡，所以ACh的水平较低。

图1.用于测量来自A549人肺癌细胞的ACh的新斯的明的浓度的优化。（A）在SF-RPMI中培养A549人肺癌细胞，并在不同浓度的新斯的明存在下测量产生的ACh量。在100-200uM新斯的明存在下，ACh的基线量最高。（B）Western印迹分析显示在三种人肺癌细胞系即A549，H358和H650中存在稳定量的AChE。由*表示的值相对于对照具有统计学显着性（* P <0.05）。

食谱

无血清RPMI（SF-RPMI），100ml
向无菌瓶中的50ml RPMI中加入以下物质：
100mg BSA，搅拌溶解
1 ml ITS
100μl50μM氢化可的松
1 mg EGF
用RPMI
将体积补至100 ml 使用0.22μm过滤器过滤灭菌
储存在4°C
炔诺酮（储存= 100mM）
在无菌微量离心管中称重33.4mg新斯的明将其溶于高压灭菌水中
在多个微量离心管中分装
储存于-20°C

致谢

我们要感谢本协议所基于的以下出版物：Song 等人（2008）; Song 等人（2003a）; Song等人（2003b）。我们感谢Srikumar Chellappan博士及其实验室的持续支持。这项工作得到了来自美国佛罗里达州迈阿密的航空助理医学协会的青年临床科学家奖（＃82115），以及从NIH到PDG的1R15CA161491-01A1的支持。 KCB是WVSGC研究生奖学金的接受者。

参考文献

Cancer，I.A.R.C. （2004）。 IARC关于评估人类致癌风险的专着。 In烟雾和非自愿吸烟：IARC，里昂，法国。 51-1187。
Lau，JK，Brown，KC，Thornhill，BA，Crabtree，CM，Dom，AM，Witte，TR，Hardman，WE，McNees，CA，Stover，CA，Carpenter，AB，Luo，H.，Chen，YC，Shiflett ，BS和Dasgupta，P。（2013）。抑制胆碱能信号传导引起人支气管肺泡癌的凋亡。 /em> 73（4）：1328-1339。
Song，P.，Sekhon，HS，Fu，XW，Maier，M.，Jia，Y.，Duan，J.，Proskosil，BJ，Gravett，C.，Lindstrom，J.，Mark，GP，Saha，和Spindel，ER（2008）。激活的胆碱能信号传导在鳞状细胞肺癌中提供了一个靶点。 68（12）：4693-4700。
Song，P.，Sekhon，H.S.，Jia，Y.，Keller，J.A.，Blusztajn，J.K.，Mark，G.P.and Spindel，E.R。（2003）。乙酰胆碱由小细胞肺癌合成，并作为小细胞肺癌的自分泌生长因子。 Cancer Res 63（1）：214-221。
Song，P.，Sekhon，H.S.，Proskocil，B.，Blusztajn，J.K.，Mark，G.P.and Spindel，E.R。（2003）。肺癌对乙酰胆碱的合成生命科学（18-19）：2159-2168。
吸烟的健康后果。（2004）。卫生署吸烟与健康办公室，DHHS，华盛顿特区的报告