Determination of Total Prokaryotes in Environmental Samples- Quantitative Real-time PCR of 16SrRNA Gene (SYBR Green)   

材料与试剂

1. 16SrRNA引物：以515F-806R为例
   515F: GTGYCAGCMGCCGCGGTAA
   806R: GGACTACNVGGGTWTCTAAT
2. DNA模板
3. 含有目标片段的标准品 (一般情况下是含有目标片段的克隆质粒)
4. 各种型号的枪头
5. PCR八连管
6. SuperReal 荧光定量预混试剂增强版 (SYBR Green) 试剂盒 (TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD, FP205)
   试剂盒中包含：
   
   6.1

   2x SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)
           SuperReal PreMix Plus采用了独特的双组分热启动DNA聚合酶 (化学修饰的HotStar Taq DNA聚合酶和抗体修饰的Anti Taq DNA聚合酶)，从而构成酶活自动调节系统，配合精心优化buffer体系，具有高扩增效率，高扩增特异性和宽广的可信范围的特点。
           该产品Buffer体系平衡了K⁺ 和NH4⁺的比例，还特别添加了独创的H-Bond因子，能协同调整反应体系中的氢键能力，使引物模板退火条件更加严谨，反应的专一性增强，重复性更好。
           SuperReal PreMix Plus中预混有SYBR Green Ⅰ, PCR反应液配制时，只需加入模板，引物，灭菌蒸馏水便可进行Real Time PCR反应。
   6.2

   50x ROX Reference Dye
           该产品附带ROX Reference Dye，用于消除信号本底以及校正孔与孔之间产生的荧光信号误差，针对不同型号的荧光定量PCR仪时选择对应浓度使用。
   
   6.3

   RNase-Free ddH₂O

仪器设备

1. Bio-Rad CFX96^TM Real-Time System
2. PCR管离心机
3. 2 ml离心管离心机
   

软件和数据库

需安装软件：

1. Bio-Rad CFX96^TM Real-Time System的所有配套软件

实验步骤

一、建立Real-Time PCR反应体系

1. 溶解2x SuperReal PreMix Plus和50x ROX Reference Dye模板，引物和RNase-Free ddH₂O，并将所有试剂在室温下平衡并彻底混匀。
   注：2x SuperReal PreMix Plus中含有荧光染料SYBR Green I, 保存该产品或配置PCR反应液时应避免强光照射；如果试剂没有混匀，其反应性能会有所下降。使用时请上下颠倒轻轻混匀，不要使用振荡器进行混匀，尽量避免出现泡沫，并经瞬时离心后使用。
2. 建议置于冰上进行反应体系的配置
   常用反应体系配置如下表1：
   
   表1.常用反应体系配置
   

   组成成分	50 µl体系	25 µl体系	20 µl体系	终浓度
   2x SuperReal PreMix Plus	25 µl	12.5 µl	10 µl	1x
   正向引物 (10 µM)	1.5 µl	0.75 µl	0.6 µl	0.3 µM
   反向引物 (10 µM)	1.5 µl	0.75 µl	0.6 µl	0.3 µM
   cDNA模板	-	-	-	-
   50x ROX Reference Dye	-	-	-	-
   RNase-Free ddH2O	至50 µl	至25 µl	至20 µl	-

   注：引物纯度对反应特异性影响很大，建议使用PAGE级别以上纯化的引物。20 µl反应体系中，基因组DNA或cDNA模板的使用量一般小于100 ng。不同仪器的最适ROX Reference Dye浓度请参考试剂盒说明书。引物终浓度在0.3 µM可以在大多数体系中获得良好的扩增结果，扩增效率不高时，可增加PCR反应体系中的引物浓度；发生非特异性扩增时，可适当减少PCR反应体系中的引物浓度，需要进一步优化引物浓度的，可在0.2-0.5 µM范围内调整。
   
   

二、进行Real time PCR反应

1. 两步法反应程序如下表2：
   
   表2. 两步法qPCR程序设置
   

   阶段	循环	温度	时间	内容	荧光信号采集
   预变性	1x	95 °C	15 min	预变性	否
   PCR反应	40x	95 °C	10 s	变性	否
   		60-66 °C	20-32 s	退火/延伸	是
   溶解曲线分析 (Melting/Dissociation Curve Stage)

   
   
2. 三步法反应程序如下表3：
   
   表3. 三步法qPCR程序设置
   

   阶段	循环	温度	时间	内容	荧光信号采集
   预变性	1x	95 °C	15 min	预变性	否
   PCR反应	40x	95 °C	10 s	变性	否
   		50-60 °C	20 s	退火	否
   		72 °C	20-32 s	延伸	是
   溶解曲线分析 (Melting/Dissociation Curve Stage)

   注：建议采用两步法PCR反应程序进行反应。当出现模板浓度过低引起非特异性扩增，引物Tm值较低导致的扩增效率低下或扩增曲线重现性不佳等现象时，建议尝试进三步法PCR扩增反应。PCR反应的预变性条件必须设定为95 °C 15 min, 用以充分激活热启动酶。
   
   

三、盖上反应管，轻柔混匀。可短暂离心，确保所有组分均在管底。
四、将反应体系置于荧光定量PCR仪中，开始反应。
五、用上述体系及反应条件构建标准曲线
        制备含有16SrRNA基因目标片段的质粒并测定其浓度。根据如下公式计算质粒的基因拷贝数：
       
        对质粒进行10倍稀释，将其稀释至少5个梯度。每个梯度的质粒做3个重复，最终R²高于0.99，E值在90%-110% 的标准曲线即为合格。
对环境样本中原核生物的总量进行测定
        将合格标准曲线的质粒，环境样本和空白对照同时运用上述反应体系及反应条件来测定环境样本中原核生物的总量。环境样本也需做3个重复。

结果与分析

1. 标准曲线的结果如下图1：
   
   
   图1. 标准曲线
   
   
2. 环境样本中原核生物的总量测定
   
   2.1

   单位体积液体环境样本中原核生物的总量：
   
   y: 单位体积液体环境样本中原核生物的总量 (copies/ml)
   x: 单位体积提取的DNA中原核生物基因拷贝数 (copies/µl)
   v₁: 从环境样本中提取的DNA体积 (µl)
   v₂: 提取v₁体积 DNA所需过滤的液体环境样本体积 (ml)
   示例：每毫升热泉水中原核生物的总量：
   使用Mobio试剂盒对过滤不同体积 (ml) 热泉水样的0.22 µm滤膜进行DNA提取，最终获得100 μl DNA。吸取1 µl DNA配置qPCR反应体系，直接得到1 µl DNA中原核生物的基因拷贝数 (3个平行样本的平均值) ，再通过上述公式换算，最终得到每毫升热泉水中原核生物的总量，结果如下图2。
   
   
   图2. qPCR得到的热泉水样中的生物量

   
   
   2.2

   单位质量固体环境样本中原核生物的总量：
   
   y: 单位质量固体环境样本中原核生物的总量 (copies/g)
   x: 单位体积提取的DNA中原核生物基因拷贝数 (copies/µl)
   v: 从环境样本中提取的DNA体积 (µl)
   m: 提取v体积 DNA所需的固体环境样本质量 (g)
   示例：每克热泉沉积物中原核生物的总量：
   使用Mobio试剂盒对0.3 g热泉沉积物进行DNA提取，最终获得100 μl DNA。吸取1 µl DNA配置qPCR反应体系，直接得到1 µl DNA中原核生物的基因拷贝数 (3个平行样本的平均值) ，再通过上述公式换算，最终得到每克热泉沉积物中原核生物的总量，结果如下图3。
   
   
   图3. qPCR得到热泉沉积物中的生物量
   
   热泉每毫升水中原核生物的总量和每克沉积物中原核生物的总量对比，结果如下图4：
   
   
   图4. 热泉水和沉积物中生物量的对比
   
   
   

失败经验

荧光定量PCR实验中常见的问题及解决方法

1. 无扩增信号或扩增曲线起峰晚或仅有引物二聚体，可能原因及相应解决方法如下表4：
   
   表4. 样品扩增存在问题的解决方法
   
   
   
2. NTC出现较高的荧光值的可能原因和解决方法如下表5
   
   表5. 空白对照存在问题的解决方法
   

   原因	解决方法
   试剂污染	使用新试剂进行实验
   PCR反应液配制时发生污染	采取必要的防污染策略

   
   
3. 出现引物二聚体和 (或) 非特异性扩增的可能原因和解决方法如下表6:
   
   表6. 非特异性扩增问题的解决方法
   
   
   
4. 定量值重现性差的可能原因和解决方法如下表7：
   
   表7. 同一样品重现性不好的解决方法
   
   

致谢

        科技部重点研发课题（2019YFC1905001）“城市有机固废生物转化功能菌群及其代谢网络调控的基础理论”。国家自然科学基金（41807316）“高温热泉嗜热微生物对非甲烷短链气态烷烃厌氧氧化潜力的研究”。

参考文献

1. Wei, Z. Y., Liu, Y. Y., Feng, K., Li, S. Z., Wang, S., Jin, D. C., Zhang, Y., Chen, H. R., Yin, H. Q. and Xu, M. Y. (2018). The divergence between fungal and bacterial communities in seasonal and spatial variations of wastewater treatment plants. Sci Total Environ 628-629:969-978.
2. Zhang, Z. J., Qu, Y. Y., Li, S. Z., Feng, K., Wang, S., Cai, W. W., Liang, Y. T., Li, H.; Xu, M. Y. and Yin, H.Q. (2017) Soil bacterial quantification approaches coupling with relative abundances reflecting the changes of taxa. Sci Rep 7:4837.
3. Tettamanti Boshier, F. A., Srinivasan, S., Lopez, A., Hoffman, N. G., Proll, S., Fredricks, D. N., Schiffer, J. T. and Caporaso, J. G. (2020). Complementing 16S rRNA Gene Amplicon Sequencing with Total Bacterial Load To Infer Absolute Species Concentrations in the Vaginal Microbiome. mSystems 5:2.