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环境样本中原核生物的总量测定—16SrRNA基因荧光定量PCR (SYBR Green染料法)

Determination of Total Prokaryotes in Environmental Samples- Quantitative Real-time PCR of 16SrRNA Gene (SYBR Green)

何 何晴
王尚 王尚
邓 邓晔

发表时间: 2021年04月25日 DOI: 10.21769/BioProtoc.2003691 浏览次数: 4968

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微生物组实验手册：架起各领域通向微生物组世界的桥梁
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摘要：实时荧光定量PCR (Quantitative Real-time PCR) 是目前主流的原核微生物绝对定量方法 (Wei et al., 2018; Zhang et al., 2017)。该技术得到结果与其他生物量测定方法 (如ATP、流式细胞及PLFA) 得到的结果一致性较好 (Zhang et al., 2017)。另外，最新研究表明qPCR在研究单个微生物绝对丰度方面表现出绝对优势，即通过qPCR (细菌或古菌总量) 与高通量扩增子测序 (各类微生物的相对丰度) 的结合，可以获得某一类群的绝对丰度，这避免了针对单个微生物类群设计特异性探针的麻烦(Tettamanti et al., 2020)。对于相对丰度大于10%的微生物来说，这种方法获得的绝对丰度可以代替靶向qPCR的检测结果。该技术通过PCR扩增过程中荧光化学信号的累积对PCR反应产物进行实时监测，利用公式换算实现对单位体积 (或质量) 环境样本中原核生物总量的定量分析。该技术主要分为SYBR Green染料法和Taqman探针法，本文主要介绍SYBR Green染料法实验流程及其应用。

Keywords: 实时荧光定量PCR search 16SrRNA search SYBR Green染料法 search

材料与试剂

  1. 16SrRNA引物：以515F-806R为例
    515F: GTGYCAGCMGCCGCGGTAA
    806R: GGACTACNVGGGTWTCTAAT
  2. DNA模板
  3. 含有目标片段的标准品 (一般情况下是含有目标片段的克隆质粒)
  4. 各种型号的枪头
  5. PCR八连管
  6. SuperReal 荧光定量预混试剂增强版 (SYBR Green) 试剂盒 (TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD, FP205)
    试剂盒中包含：
    6.1
    2x SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)
            SuperReal PreMix Plus采用了独特的双组分热启动DNA聚合酶 (化学修饰的HotStar Taq DNA聚合酶和抗体修饰的Anti Taq DNA聚合酶)，从而构成酶活自动调节系统，配合精心优化buffer体系，具有高扩增效率，高扩增特异性和宽广的可信范围的特点。
            该产品Buffer体系平衡了K+ 和NH4+的比例，还特别添加了独创的H-Bond因子，能协同调整反应体系中的氢键能力，使引物模板退火条件更加严谨，反应的专一性增强，重复性更好。
            SuperReal PreMix Plus中预混有SYBR Green Ⅰ, PCR反应液配制时，只需加入模板，引物，灭菌蒸馏水便可进行Real Time PCR反应。
    6.2
    50x ROX Reference Dye
            该产品附带ROX Reference Dye，用于消除信号本底以及校正孔与孔之间产生的荧光信号误差，针对不同型号的荧光定量PCR仪时选择对应浓度使用。
    6.3
    RNase-Free ddH2O

仪器设备

  1. Bio-Rad CFX96TM Real-Time System
  2. PCR管离心机
  3. 2 ml离心管离心机

软件和数据库

需安装软件：

  1. Bio-Rad CFX96TM Real-Time System的所有配套软件

实验步骤

Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式：何晴, 王尚, 邓晔. (2021). 环境样本中原核生物的总量测定—16SrRNA基因荧光定量PCR (SYBR Green染料法). // 微生物组实验手册. Bio-101: e2003691. DOI: 10.21769/BioProtoc.2003691.
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How to cite: He, Q., Wang, S. and Deng, Y.  (2021). Determination of Total Prokaryotes in Environmental Samples- Quantitative Real-time PCR of 16SrRNA Gene (SYBR Green). // Microbiome Protocols eBook. Bio-101: e2003691. DOI: 10.21769/BioProtoc.2003691.
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分类

系统生物学 > 微生物组学

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