研究背景

微生物无处不在，从自然环境到极端环境，几乎生态系统都能发现它们的身影。微生物组是特定环境或生态系统中所有微生物及其遗传信息的总和[1]，它不仅深刻影响着环境和生态平衡[2]，还与人类健康[3]、农业发展[4]和环境保护[5]等方面密切相关。近年来，微生物组研究已成为生命科学领域的热点，相关研究文献的数量持续激增，反映了这一领域的重要性[6]和广泛关注。在微生物组研究中，扩增子分析作为一种高效且经济的技术，因其特定基因片段（如16S rDNA）进行分析的特性，在揭示微生物群落结构和多样性方面表现尤为突出。凭借成本低、特异性强、操作简便等优势[7]，扩增子分析已被广泛应用于环境微生物监测、医学微生物学、农业科学等多个领域[8]。
QIIME（Quantitative Insights Into Microbial Ecology）[9]是扩增子数据分析的经典工具，自发表以来就因其易用性和高效性深受研究人员的青睐。然而，随着高通量测序技术的发展，数据体量迅速增加，传统的 QIIME已难以满足现代研究对计算性能和功能复杂性的要求。为了应对这些挑战，QIIME 2 [10]应运而生。QIIME 2在功能上全面升级，不仅保留了传统QIIME的优势，还提供了更强大的工具和流程来处理扩增子数据。其交互性分析功能和可视化能力显著提升了用户体验，同时保证了研究的可重复性。然而，由于 QIIME 2涉及的生物信息学知识较多，对缺乏经验的新手而言，仍存在一定的学习门槛。
本研究旨在提供一套基于 QIIME 2 2025.4 版本的标准化实验方案，针对微生物组 16S rDNA 基因扩增子测序数据的处理与分析。同时，该实验方案也属于EasyAmplicon扩增子分析流程[11]的一部分，EasyAmplicon的分析结果可导入QIIME 2 2025.4进行后续分析。该方案的核心原理包括以下几个关键步骤：
1. 数据导入
将原始测序数据以 QIIME 2支持的格式导入，以确保数据兼容性和分析的顺畅。
2. 去噪与特征生成
使用DADA2[12]等方法去除测序误差，生成高分辨率的特征（ASV，Amplicon Sequence Variants）。ASV 是单碱基分辨率的序列单位，比传统的OTU（Operational Taxonomic Units）分类方法更准确，能够反映微生物群落的真实组成。
3. 多样性分析
通过计算α多样性（如香农指数、观察物种数）和β多样性（如PCoA和NMDS分析）量化微生物群落的多样性和相似性，揭示不同样本之间的生态学差异。
4. 物种注释
利用分类学数据库（如SILVA或Greengenes），对ASV进行物种注释，解析群落组成，并挖掘潜在的功能信息。
5. 差异分析
通过统计学方法（如ANCOM或LEfSe），识别在不同实验组之间具有显著差异的微生物种类，探索其与环境因素或健康状态的关联。
通过以上步骤，本方案不仅能够高效完成扩增子数据的标准化处理，还为研究者提供了直观的结果可视化和交互式探索工具。本文还附有操作视频，对代码实现和关键分析步骤进行详细讲解，以帮助新手快速掌握QIIME 2的使用方法，为同行提供便捷的学习和参考资源。

仪器设备

1. (可选）推荐使用计算服务器（操作系统：Linux主流发行版本，如CentOS 8+/Ubuntu 22.04+；CPU：4核+；内存：16G+；硬盘：> 10 GB，且大于原始数据大小3倍），网络访问畅通。
2. 个人电脑推荐Windows 10系统，内存8G+。需先在应用商店中安装Linux子系统（如Ubuntu 24.04 LTS），然后安装QIIME 2 2025.4；也可使用VirtualBox虚拟机运行QIIME 2镜像，但效率较低不推荐使用；Mac系统可直接安装QIIME 2 2025.4。(可选）Windows用户远程访问服务器需安装XShell 8.0+或Putty等终端类软件，Mac使用系统内置终端即可远程访问计算服务器。
   

软件和数据库

软件及数据库介绍（视频1）

1. QIIME 2可运行的四种环境任选其一：Linux服务器（推荐，适合大数据）、Windows 10子系统Ubutnu 24.04 LTS（推荐，适合小数据）、Windows中VirtualBox虚拟机中运行Ubutnu 24.04 LTS（不推荐，小数据集且效率低）、Mac系统（不推荐，兼容性问题较多）
2. 软件管理器Miniconda3 Linux 64-bit（Python 3.10+）：https://docs.anaconda.net.cn/miniconda/miniconda-other-installer-links/
3. QIIME 2 [10]发行版 2025.4：https://docs.qiime2.org/2025.4/index.html
   Greengenes 2 [13] 分类器（参考序列和物种分类信息）：
   https://ftp.microbio.me/greengenes_release/2022.10/2022.10.backbone.full-length.fna.qza
   https://ftp.microbio.me/greengenes_release/2022.10/2022.10.backbone.tax.qza
   
4. 流程示例参考代码和结果文件详见：https://github.com/YongxinLiu/EasyAmplicon/blob/master/qiime2/pipeline_qiime2.sh
5. (可选）远程文件传输工具WinSCP客户端6.5：https://winscp.net/eng/download.php
6. (可选）Windows远程访问服务器终端工具Xshell 8.0：https://www.xshell.com/zh/xshell/
7. (可选）R语言环境，下载适合自己系统的安装包（版本：4.4.3+）： https://www.r-project.org/ ，本次演示最新版R4.5.0下载安装。
8. (可选） R语言开发环境RStudio，用于执行流程，下载适合自己系统的安装包（版本：2024.12.1+563）： https://posit.co/download/rstudio-desktop/
   

软件安装和数据库部署

QIIME 2不支持在Windows系统下直接安装。我们主要介绍远程访问Linux服务器和Windows 10下安装Linux子系统并使用QIIME 2的两种方法，任选其一即可。
方法1. 远程访问Linux服务器：Windows/Mac用户安装WinSCP客户端，用于上传测序数据至服务器或数据中心，也可用于下载分析结果本地查看。Windows用户安装Xshell用于远程访问服务器并开展分析，Mac用户可使用系统自带Terminal中的ssh命令远程访问服务器。
方法2. Windows 10的1609以后的版本可以安装Linux子系统：开始→Microsoft Store→搜索“Ubuntu”→选择“Ubuntu 24.04 LTS”→安装。安装前的系统设置和常见问题请阅读《Windows10安装Linux子系统Ubuntu 20.04LTS》。安装成功后可以在开始中启动“Ubuntu 24.04 LTS”的命令行，也可选在RStudio中设置默认Terminal为“Bash（Windows Subsystem for Linux）”，打开新终端即可使用。
在Linux系统下，以Miniconda3软件和Python3虚拟环境安装QIIME 2流程；然后下载16S rRNA基因数据库，建立物种分类器（视频2）。
注： 下文代码行添加灰色底纹背景， 其中需要根据系统环境修改的部分标为蓝色。

1. 安装Miniconda3 Linux 64-bit（已安装请跳过） 
   
   wget -c https://repo.anaconda.com/miniconda/Miniconda3-latest-Linux-x86_64.sh
   bash Miniconda3-latest-Linux-x86_64.sh
   ~/miniconda3/bin/conda init
   
   

2. Conda新建环境安装QIIME 2（原始链接）
   
   conda env create \
   --name qiime2-amplicon-2025.4 \

   --file https: raw.githubusercontent.com qiime2 distributions refs heads dev 2025.4 amplicon released qiime2-amplicon-ubuntu-latest-conda.yml
   
   备用链接
   
   wget -c http://www.imeta.science/db/qiime2/qiime2-amplicon-ubuntu-latest-conda.yml
   
   conda env create \
   --name qiime2-amplicon-2025.4 \
   --file qiime2-amplicon-ubuntu-latest-conda.yml
   
   检查是否安装成功
   
   conda activate qiime2-amplicon-2025.4

实验步骤