Application of Biacore Technology to Detect the Affinity of Hnt3 Protein to Double-stranded DNA   

材料与试剂

1. S系列SA芯片（Cytiva，BR100531）
2. Tris、HCl、NaCl、NaOH、β-巯基乙醇、Tween 20（Sigma-Aldrich公司）
3. 酵母Hnt3全长蛋白、Hnt3∆32 (残基33-232)截短体及多种突变体，储存在缓冲液（20 mM Tris-HCl pH8.0，100 mM NaCl，5 mM β-巯基乙醇）中。蛋白质的表达纯化方法参见文献1。Hnt3全长232个氨基酸，分子量为26.9 kD；Hnt3∆32 (残基33-232)截短体，分子量为23.6 kD；其余突变体C130A，H138A，S142A，T212A，F34A，K161A均为Hnt3∆32的氨基酸点突变。蛋白样品均为新鲜纯化浓缩，浓度为~200 μM。
4. DNA由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，合成两条单链核苷酸。
   其中一条链3′端在合成时加上生物素标记（5'-ATTCCGATAGTGAC-3'-biotin），另一条为其互补链，无生物素标记（5'-GTCACTATCGGAAT-3'）。双链DNA（dsDNA）分子量为8.9 kD。
5. 其他耗材：1.5 mL EP管, 1 mL, 200 µL, 10 µL枪头均为Axygen公司产品。
6. 0.22 μm微孔滤膜
   

仪器设备

1. Biacore T100（GE, Healthcare）
2. 超纯水仪（Millipore）
   

实验步骤

一、Biacore实验前准备

1. 双链DNA的制备：将合成的两条单链DNA分别按照100 μM浓度溶解在10 mM Tris–HCl (pH 8.0) ，50 mM NaCl 缓冲液中，各取50 µL单链DNA溶液混合至EP管，将EP管置于95 ℃ PCR仪加热变性5分钟，然后缓慢冷却2小时左右至25 ℃退火，在这个过程中两条单链DNA互相配对形成双链，得到100 µL终浓度为50 μM的双链DNA。
2. 运行缓冲液的制备：运行缓冲液配方为20 mM Tris-HCl, pH7.5, 100 mM NaCl和0.005% (v/v) Tween 20。配制过程如下：首先进行储液配制。1 M Tris-HCl储液制备：取121.14 g Tris溶解在1L纯水中用HCl调节pH到7.5，室温储存；1 M NaCl储液制备：取58.5 g NaCl溶解在1 L纯水中，室温储存。运行缓冲液使用前新鲜配制，取20 mL 1 M Tris-HCl母液，100 mL 1 M NaCl母液，0.05 mL的Tween 20，加纯水定容至1 L，使用前0.22 μm微孔滤膜抽滤。SPR实验中，DNA和蛋白的稀释均用此缓冲液。
3. 蛋白样品和DNA均离心处理：12,000× g离心5分钟，将粘附管壁的溶液和样品离心下来，去除气泡和杂质，以免对仪器信号造成影响。
4. 配制含50 mM NaOH和1 M NaCl的溶液。先配制0.5 M NaOH母液：称取2 g NaOH粉末，用100 mL纯水溶解，0.22 μm微孔滤膜过滤备用。4 M NaCl母液：称取23.36 g NaCl粉末，用100 mL纯水溶解，0.22 μm微孔滤膜过滤备用。取100 μL 0.5 M NaOH和250 μL 4 M NaCl到650 μL纯水，用移液器多次吹打，离心去掉气泡，得到1 mL含50 mM NaOH和1 M NaCl的溶液。
5. 点击undock，将维护芯片更换为S系列SA芯片，放入500 mL运行缓冲液，Prime。仪器实验温度维持25 ℃。

二、DNA固定
根据核酸和蛋白的分子量计算，固定量为40 RU时，全长蛋白的Rmax为121 RU（40*26.9/8.9），截短体为106 RU，是比较好的实验条件。将DNA用缓冲液稀释至50 nM。选择自动化程序固定，Run Wizard→Surface Preparation→immobilization。Chip type选择SA，Flow cell1（Fc1）空白，Flow cell2（Fc2）目标固定量设置为40 RU（图1）。该程序中，系统流速为10 μL/min，芯片表面将用含50 mM NaOH和1 M NaCl的溶液，进样三次，每次60 s（图2A），将芯片表面多余的Streptavidin蛋白去掉。Fc2 DNA进样1 ul，达到要求，自动停止进样，程序显示固定38.2RU（图2B）。
我们将DNA固定的部分信号放大，发现进样前后其实只有17 RU的信号上升，由于基线漂移，系统计入的固定量更高（图2C）。于是我们用Manual Run模式，加入DNA 20 s，再次固定DNA 22.8 RU（图2D），总体固定量达到40 RU。


图1. SA芯片固定DNA的程序设定.

我们将DNA固定的部分信号放大，发现进样前后其实只有17 RU的信号上升，由于基线漂移，系统计入的固定量更高（图2C）。于是我们用Manual Run模式，加入DNA 20 s，再次固定DNA 22.8 RU（图2D），总体固定量达到40 RU。


图2. SA芯片固定DNA过程.
A. 空白通道Fc1三次含50 mM NaOH和1 M NaCl的溶液处理；B. 实验通道Fc2三次含50 mM NaOH和1M NaCl的溶液处理，之后固定DNA；C. Fc2进样DNA时的局部放大图；D. 手动模式补加DNA。2920为DNA编号。

三、分析物测试条件摸索

1. 分析物是否有结合：因为预估亲和力不会太强，先配25 μM Hnt3全长蛋白，测试其是否结合DNA、结合的模式以及反应信号的高低。采用Manual Run模式，设置30 μL/min流速，进样60 s，结合信号为106 RU，几乎快达到理论Rmax (121 RU) （图3A）。结合曲线显示Hnt3与DNA属于快结合快解离，不需要再生，进样时间设置60 s即可。
2. 摸索实验浓度梯度：选择构建的突变体是在结构中Hnt3与DNA有互作的氨基酸，推测会造成亲和力的下降。测试50 μM Hnt3、Hnt3∆32 及突变体C130A，H138A，S142A，T212A，F34A，K161A分别与DNA的结合，条件仍然为30 μL/min流速，进样1 min。Hnt3信号与25 μM对比，增长不多，判断达到饱和，可考虑设置50 μM为Hnt3亲和力测试时的最高浓度。Hnt3∆32、C130A、H138A和S142A的结合信号比Hnt3低一些，再结合母液浓度，考虑设置100 μM为亲和力测试时的最高浓度。F34A、K161A和T212A结合信号只有10 RU和38 RU，说明亲和力非常弱，结合母液浓度，很难做更高浓度梯度（图3B）。
   
   
   图3. Hnt3、Hnt3∆32 及突变体与DNA结合的初步结果.
   A. 25 μM Hnt3与DNA的结合曲线；B. 50 μM分析物与DNA的结合曲线。图中Hnt3（33-232）代表Hnt3∆32。上述曲线均为扣减Fc1背景信号后的Fc2-1信号。

四、亲和力实验方法的建立
根据前期实验结果，确定了亲和力测定的实验条件（图4）：控制软件选择Run Wizard→Kinetics/Affinity→Flow path 2-1；3个startup cycles；实验条件为：流速30 μL/min，进样60 s（C130A因为样品量少，进样30 s），解离60 s；样品浓度梯度Hnt3为0，0.39，0.78，1.56，3.12，6.25，6.25，12.5，25，50 μM（6.25 μM重复一次），Hnt3∆32、C130A、H138A和S142A为0，1.56，3.12，6.25，12.5，25，50，100 μM。样品会同时流过Fc1和Fc2，减去对照通道信号的Fc2-1将会用来计算亲和力。


五、样品准备和上机
Startup cycles和0浓度均用运行缓冲液，蛋白用运行缓冲液对半梯度稀释，程序要求体积为98 μL（1.5 mL EP管），考虑到移液器误差和蒸发因素，每个样品浓度按110 μL配制，Hnt3 6.25 μM因为重复，体积200 μL。稀释完后12,000× g离心5分钟，剪掉EP管盖子，放到Sample Rack对应的位置。


图4. 亲和力测定程序设置.

六、数据分析
本次实验数据处理软件为Biacore T100 Evalutaion Software（Versions2.0）。由于Hnt3与DNA的互作属于快结合快解离，因此选择“Steady State Affinity”模型。过程如下：用Biacore T100 Evalutaion Software打开数据，点击Kinetics/Affinity，选择Surface bound，选择合适的数据包括零浓度，点击“Next”，软件会自动扣减零浓度。点击“Affinity”，软件会计算进样结束前4 s的结合信号。点击“Next”，Model选择“Steady State Affinity”，点击“Fit”，程序会给出拟合结果。

实验注意要点

1. 生物素化DNA固定到SA芯片时，如果在自动化程序中设置了目标固定量，仪器会自动进样，达到目标信号即停止。当设置的固定量比较高时没问题，但当数值比较小时，误差会比较大。原因是芯片表面会先用含50 mM NaOH和1 M NaCl溶液处理，之后基线会向上漂移，系统记录的固定量会包括一部分漂移信号，导致固定量高。
2. 如果自动固定没有达到预期，需要补加生物素化样品时，不能使用软件里SA芯片的自动化固定程序。因为该程序默认了三次含50 mM NaOH和1 M NaCl溶液处理，会破坏之前固定的样品活性。此时，推荐Manual Run手动进样模式（Biacore T100）。如果是Biacore 8K仪器，没有手动进样模式，可以在固定程序里将前处理命令删除。
3. 生物素化DNA固定到SA芯片，和蛋白氨基偶联相比，过程简单，也没有样品活性率的问题。
4. 在蛋白-DNA的SPR互作分析中曾多次出现快结合快解离的模式。此类实验不需要摸索再生条件，相对简单。它的主要问题是找到合适的浓度梯度，因为用“steady state affinity”模型拟合时，出现饱和趋势才能获得准确的Rmax，继而计算出的亲和力数据才会准确。有些亲和力特别弱的，受制于样品浓度，可能无法得到可靠的亲和力数据。另外，当分析物所用浓度较高时，要注意观察对照通道是否产生非特异结合信号。
   

结果与数据分析

Hnt3突变体F34A、K161A在50 μM时只有10 RU信号（图3B），亲和力大大减弱，结合母液浓度，很难做更高浓度梯度来计算亲和力，所以我们给出了“ND”（not determined）的结论（表1）。在Hnt3-DNA复合物晶体结构中，残基 Phe34 与核苷酸形成堆叠相互作用，对暴露的碱基进行末端加帽，发挥关键的作用。F34A突变体表现出 DNA 结合亲和力明显下降，提示Phe34在识别DNA的过程中具有必不可少的作用。Lys161通过与核苷酸相互作用固定 DNA 骨架的裂隙，突变体将严重影响Hnt3与DNA之间的相互作用1。
突变体T212A在50 μM时结合信号为38 RU左右（图3B），高于F34A、K161A，低于其它突变体，说明它的亲和力介于它们之间，受限于样品量，该样品没有做浓度梯度，但根据50 μM时的结合信号，可以做排序。晶体结构中，Thr212与DNA的磷酸骨架直接相互作用，结合SPR结果，说明该突变体影响了Hnt3与DNA之间的相互作用，重要性弱于Phe34和Lys161。
Hnt3、Hnt3∆32、C130A、H138A和S142A都通过“steady state affinity”模型得到了亲和力数据（图5，表1）。全长Hnt3蛋白与DNA结合时的亲和常数Kd为4.26 μM，与其他突变体相比具有最高的亲和力，是Hnt3∆32与DNA亲和力的4倍，表明N端截短1-32残基可以影响Hnt3蛋白与DNA的结合。C130突变成Ala，亲和力为29.4 μM，与Hnt3∆32相比亲和力下降了1.7倍，说明其在蛋白质-DNA中有一定作用。H138、S142突变成Ala，亲和力为11.05和16.94 μM，变化不大，说明这两个氨基酸不是Hnt3与DNA互作的关键氨基酸。

表1. Hnt3、Hnt3∆32及其突变体与DNA结合的亲和力

致谢

该文章与我们之前发表在Nature structural&molecular biology（龚勇、朱德裕等，2011，DOI：10.1038/nsmb.2145）上的研究有关。

参考文献

1. Gong, Y., Zhu, D., Ding, J., Dou, C. N., Ren, X., Gu, L., Jiang, T. and Wang, D. C. (2011). Crystal structures of aprataxin ortholog Hnt3 reveal the mechanism for reversal of 5'-adenylated DNA. Nat Struct Mol Biol 18(11): 1297-1299.