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Intravascular Injection of Chicken Embryos   

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摘要:【原理】鸟类卵生的特点使其成为研究恒温动物的良好模型,其胚胎独立发育在体外,在孵化的24 h之后,血液循环已经建立,此阶段可将外源物质通过胚胎血液循环系统导入胚胎,用以研究外源物质的功能作用[1]。【目的和方法】本研究拟通过显微操作联合鸡胚血管注射探索将外源物质导入鸡胚的方法,为基因功能验证,转基因育种和嵌合体制备等生产研究提供方法。【结果】结果显示,示踪剂表明通过背主动脉和头部血管注射能够使注射物通过血液循环系统扩散至整个胚胎。胚胎荧光观察结果表明血管注射能够有效的将外源质粒和慢病毒载体导入胚胎,切片结果证明外源PGCs能够通过注射有效的进入受体生殖腺。【结论】这项技术能够为基因功能验证,胚胎和发育生物学研究,嵌合体和转基因鸡的制备提供基础技术支持。

关键词: 血管注射, 鸡胚, 鸡PGCs, 转基因鸡制备

材料与试剂

  1. 玻璃针 (NARISHIGE, catalog number: G-1)
  2. 微量上样枪头, Microloade (Eppendorf, catalog number: H129975M)
  3. 医用胶带
  4. DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) (Gibco®, catalog number: 11960044)
  5. PBS, pH 7.4 (Phosphate-Buffered Saline) (Gibco®, catalog number:10010023)
  6. 0.4%台盼蓝染液 (Trypan Blue solution) (Sigma-Aldrich, catalog number:T8154)
  7. PEI (Polyfectine) (Biowit, catalog number: PL0001)
  8. 青链霉素 (Solarbio, catalog number: P1400)
  9. 灭菌蒸馏水

仪器设备

  1. 手术镊
  2. 眼科镊
  3. 拉针仪 (NARISHIGE, model: PC-100)
  4. 磨针仪 (NARISHIGE, model: EG-401)
  5. 37 °C培养箱 (Thermo scientific, model: 4110)
  6. 体视显微镜 (OLYMPUS, model: MVX10)
  7. 10 μl微量移液器(Eppendorf,Eppendorf Reference® 2, catalog number: 4921000052)
  8. 显微注射仪 (NARISHIGE, model: UT10)
  9. 孵化箱(无锡设备厂,型号:鸣凤4820型)

实验步骤

一、注射针制备
取玻璃针置于拉针仪,固定好后点击Turn on 按钮,将拉好的玻璃针固定于磨针仪上,打开磨针仪开关,在观察视野下轻轻推动针尖至磨针仪转盘上,同时滴加灭菌蒸馏水,针尖出现45°切口后将玻璃针取出,置于紫外灯下消毒2小时以备注射用。

二、鸡胚血管注射

  1. 注射外源物质准备
    1. 载体准备:普通的转染载体可通过与脂质体混合,一般而言,质粒需要经过去内毒素处理,脂质体可选用PEI或其他商品化脂质体试剂。转染前,将转染质粒(质量)与脂质体(体积)以1:3的比例混合后置于37 °C培养箱孵育20分钟备用。
    2. 慢病毒载体制备:注射用的慢病毒载体滴度应至少为5 × 106 Tu/ml,注射前计算好注射剂量和浓度,将慢病毒置于冰上融化备用。
    3. 鸡PGCs:培养的鸡PGCs或修饰后的PGCs经过计数后,将PGCs使用DMEM稀释至注射浓度,按照1,000-1,500个细胞/胚进行注射,注射量不大于5 μl。
  2. 鸡胚血管寻找
    取新鲜受精蛋,置于孵化箱中孵化至48-58 h(13-17 HH),使用新洁尔灭对蛋壳进行浸泡和清洗,再使用75%酒精进行擦拭,使用手术镊子轻轻敲开胚蛋顶部,打开一个直径不大于1 cm的圆孔,在体视显微镜下找到胚胎位置,在体视显微镜下使用眼科镊轻轻挑开外壳膜,露出胚胎血管。
  3. 鸡胚血管注射
    将需要导入的外源物质使用微量移液器通过枪头填入玻璃针(注释:填入过程应缓慢吸取和填入,避免气泡冲入玻璃针),然后根据注射量调整注射器气压,在体视显微镜下缓慢沿胚胎背主动脉血管方向刺入注射针,将外源物质注入。
  4. 注射后处理
    注射后加入200 μl青链霉素至注射部位,然后使用医用胶带封口。继续放入孵化箱,孵化温度为38 °C,湿度为80%,根据后续实验需求进行处理(详细过程见图1)。


    图1. 血管注射流程. A. 注射时间和流程示意图;B. 注射位置示意图,1标示为头部血管,2为背主动脉血管;C. 血管注射流程示意

结果与分析

  1. 示踪染液注射后扩散情况
    使用0.4%细胞染色液台盼蓝进行注射,注射剂量为2 μl,注射位置为头部血管和背主动脉,可观察到蓝色染液随胚胎血管弥散至全胚,表明血管注射能够有效的使外源物质进入胚胎[2](图2)。


    图2. 示踪染液注射后扩散情况. 标尺:50mm

  2. 外源载体注射结果
    对pEGFP-N1载体进行PEI包裹,使注射液浓度为1 μg/μl,同时包裹慢病毒载体pLVX-EGFP,滴度测定后进行稀释,使病毒浓度为5 × 106 Tu/μl。对发育至2.5天胚胎分别注射包裹好的pEGFP-N1和pLVX-EGFP,4.5天将胚胎取出,置于体视荧光显微镜下观察,结果表明注射后载体携带的绿色荧光蛋白能够有效的在胚胎中表达(图3)。


     图3. 慢病毒载体和包裹质粒注射后绿色荧光的表达. 标尺:100 mm

  3. PGCs注射结果
    使用细胞膜染液将供体PGCs的细胞膜染成红色后进行注射,在18.5天时将供体胚胎的生殖腺(睾丸和卵巢)取出,固定后进行冰冻切片,结果显示,供体PGCs能够有效的进入受体的生殖腺并定居[3](图4)。


    图4. 供体PGCs(红色)注射后受体生殖腺冰冻切片. 标尺:2 mm

致谢

我们在此感谢李碧春,陈国宏,张亚妮,赵瑞丰等人的前期研究工作。

参考文献

  1. Kawabe, Y., Naka, T., Komatsu, H., Nishijima, K., Iijima, S. and Kamihira, M. (2008). Retroviral gene transduction into chicken embryo gonads through blood circulation. J Biosci Bioeng 106(6): 598-601.
  2. Wang, Y. l., Jin, K., He, N. N., Cheng, S. Z., Zuo, Q. S., Li, D., Wang, Y. J., Wang, F., Ji, Y. Q., Lu, Z. Y. et al. (2017). Research on the appropriate way to transfer exogenous substances into chicken embryos. J Integr Agric 16(10): 2257-2263.
  3. Furuta, H., Marumiya, S., Nakano, I., Yoshida, T., Mukouyama, H. and Tanaka, M. (2007). Effect of Transfer Primordial Germ Cells (PGCs) into Chick Gonad. J Poult Sci 44: 335-338.
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Copyright: © 2022 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:靳锴, 左其生, 张亚妮, 李碧春. (2022). 鸡胚血管注射. Bio-101: e1010955. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010955.
How to cite: Jin, K., Zuo, Q. S., Zhang, Y. N. and Li, B. C. (2022). Intravascular Injection of Chicken Embryos. Bio-101: e1010955. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010955.
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