Improve Research Reproducibility A Bio-protocol resource

生物钟调控基因的高通量siRNA筛选

A high-throughput siRNA Screen for Circadian Clock Modulators

李 李慧林*
欧 欧家丽*
唐 唐芸棋

*Contributed equally to this work 发表时间: 2021年06月01日 DOI: 10.21769/BioProtoc.1010821 浏览次数: 2075

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高通量筛选实验手册
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摘要: 生物节律是生物进化过程中形成的内源性的适应地球昼夜交替的机制，并对生物体内多种代谢过程和生理功能具有调控功能。在细胞内，生物节律主要通过转录-翻译反馈环进行调控，BMAL1-CLOCK复合体可以启动PER2等下游基因的表达，PER2可以通过抑制BMAL1-CLOCK复合体的转录功能。PER2作为核心节律基因之一，其表达水平具有明显的周期性，其振幅和周期也是生物节律的重要特征。因此，通过检测PER2表达水平的周期性可以反应生物节律的强弱。在本次siRNA文库筛选中，我们使用表达PER2-荧光素酶融合蛋白的小鼠MEF细胞，通过检测生物发光值的变化，来表征PER2表达水平的变化，从而发现新的可以调控生物节律的基因。本文主要介绍了运用siRNA文库以及通过检测生物发光值进行高通量筛选的方法，该方法适用性强，操作简单，有助于获得稳定的筛选结果。

Keywords: 生物节律 search siRNA文库 search Luciferase search

材料与试剂

材料

  1. 1.5 ml离心管 (QSP, 509-GRD-Q)
  2. 15 ml离心管 (JET BIOFIL, CFT-011-150)
  3. 50 ml 离心管 (JET BIOFIL, CFT-011-500)
  4. 10 ml 移液管 (JET BIOFIL, GSP010010)
  5. 10 cm dish (NUNC, 150466)
  6. 384孔板 (Corning, CLS3570BC-50EA)
  7. 0.22 μm滤器 (JET BIOFIL, FPV213500)

试剂

  1. DMEM (Thermo Fisher, 12430047)
  2. Penicillin-Streptomycin (BIOSERA, XC-A4122)
  3. 胎牛血清 (LONSERA, S711-001s)
  4. Trypsin (Thermo Fisher, 25200072)
  5. PBS (Thermo Fisher, 21300058)
  6. Opti-MEMTM I Reduced Serum Medium (Thermo Fisher, 31985070)
  7. 5x siRNA buffer (Dharmacon, B-002000-UB-100)
  8. DharmaFECT 1 Transfection Reagent (Dharmacon, T-2001-02)
  9. alamarBlueTM Cell Viability Reagent (Thermo Fisher, DAL1100)
  10. ONE-GloTM Luciferase Assay System (Promega，E6120)

仪器设备

  1. 细胞培养箱 (Thermo scientific, Heracell 150i)
  2. 生物安全柜 (Eppendorf, 1300 SERIES A2)
  3. 离心机 (Eppendorf, centrifuge 5810 R)
  4. 细胞计数仪 (Beckman Coulter, Z2)
  5. 自动化分液仪 (Thermo Fisher, Multidrop Combi)
  6. 混匀仪 (Eppendorf, ThermoMixer comfort)
  7. 多标记微孔板检测仪 (PE, envision)

实验步骤

Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式：李慧林, 欧家丽, 唐芸棋. (2021). 生物钟调控基因的高通量siRNA筛选. // 高通量筛选实验手册. Bio-101: e1010821. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010821.
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How to cite: Li, H. L., Ou, J. L. and Tang, Y. Q. (2021). A high-throughput siRNA Screen for Circadian Clock Modulators. // High-throughput Screening Protocol eBook. Bio-101: e1010821. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010821.
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