Identification of N6-methyladenosine (m6A) in RNA   

材料与试剂

1. 无酶枪头 (QSP)
2. 1.5 ml无酶EP管 (生工) 
3. 50 ml无酶离心管 (生工) 
4. 抗体孵育盒 (生工) 
5. 双面胶
6. 尼龙膜 (GE) 
7. 无酶PCR管 (Axygen) 
8. HEK293T细胞系
9. m6A抗体 (Synaptic Systems, catalog number: 202003)
10. 兔二抗 (CST) 
11. TRIzol (TAKARA) 
12. 氯仿 (广州牌) 
13. 异丙醇 (生工) 
14. 无水乙醇 (生工) 
15. DEPC处理水 (生工) 
16. 无菌1x PBS (生工) 
17. Qubit RNA HS Assay Kit (Thermo Fisher) 
18. BSA粉末 (生工) 
19. 1x TBS (生工) 
20. Tween-20 (生工) 
21. 100x亚甲蓝染液 (生工) 
22. RNA 寡聚核苷酸链(TAKARA)
    m6A-UUGGUUUUUUUUGG(m6A)CAUGUAUAUAGU-FAM
    A-UUGGUUUUUUUUGGACAUGUAUAUAGU-FAM 
23. T3 DNA连接酶 (NEB) 
24. 10x T3连接缓冲液 (NEB) 
25. 2x Taq Mix (Vazyme Biotech)
26. 0.5x TAE (生工) 
27. 琼脂粉 (生工) 
28. gel-red核酸染料 (Genestar) 
29. MazF酶 (Takara Bio Inc., catalog number: 2415A) 
30. 5x MazF buffer
31. 化学发光液 (BD) 
32. 0.5x TBE (生工) 
33. 尿素 (生工) 
34. 5x TBE (生工) 
35. 30%丙烯酰胺 (生工) 
36. 过硫酸铵(APS)粉末 (生工) 
37. 四甲基乙二胺(TEMED) (生工) 
38. 1%亚甲蓝染液 (见溶液配方) 
39. 75%乙醇 (见溶液配方)
40. 0.1%TBST (见溶液配方)
41. 3%BSA (见溶液配方)
42. 1%亚甲蓝染液 (见溶液配方)
43. 2.5%琼脂糖凝胶 (见溶液配方)
44. 10%尿素-聚丙烯酰胺胶 (见溶液配方)
45. 10% APS (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 剪刀
2. 96孔PCR管架
3. 镊子
4. 100 ml小烧杯 (生工) 
5. 低温高速离心机 (Eppendorf) 
6. 低速离心机 (Eppendorf) 
7. 移液枪 (Eppendorf) 
8. 离心管架 (生工) 
9. 通风橱
10. 水平电泳系统 (Bio-Rad) 
11. NanoDrop或Qubit 2.0 (Thermo Fisher) 
12. 紫外交联仪 (Agilent) 
13. 化学发光仪 (Bio-Rad) 
14. 干式恒温器 (杭州瑞诚) 
15. 水平摇床 (Kylin-bell其林贝尔 ) 
16. PCR仪 (Thermo Fisher) 
17. 凝胶成像仪 (Bio-Rad) 
18. 电子天平
19. 微波炉 (美的) 
20. 垂直电泳系统 (Bio-Rad) 
21. 恒温磁力搅拌器
    

软件

1. Agilent Bioanalyzer

实验步骤

注：以下实验涉及RNA操作，请做好实验台清洁和个人防护，所有实验用品按照RNA级别进行操作。
一、哺乳动物细胞总RNA提取
利用TRIzol抽提的方法抽取大量高纯度的哺乳动物细胞的总RNA，该方法能较好地保持总RNA的完整性和纯度，能够避免DNA和蛋白质的污染，适用于后续的各种分子检测实验和高通量检测实验。

1. 显微镜下观察6 cm皿中HEK293T细胞系的细胞密度生长至~80-90%，从细胞房 取出。预冷高速离心机至4 °C。
2. 用移液枪小心吸去细胞培养液，并用1x PBS润洗细胞，用枪头吸去多余的液 体，再加入2 ml 1x PBS吹打细胞 (少于2 ml会导致细胞过于黏稠)，将细胞吹均 匀后吸取到15 ml 离心管中，用800 rpm低速常温离心6 min收集细胞，去掉多 余的1x PBS。
   注：由于HEK293T细胞系是半贴壁细胞，所以推荐吹打的方式进行细胞收集。如果是贴壁细胞，可以用胰酶进行消化或者细胞刮收集的方法。如果是悬浮细胞，直接离心收集即可。
3. 取一管细胞在通风橱中加入500 μl TRIzol裂解5 min，注意要吹匀细胞，不能留 下细胞团块。每一百万个细胞可以获得5-15 μg的RNA。
   注：提取细胞RNA最好是使用新鲜的细胞样品。如果细胞过多或需要保存，可以加入TRIzol将细胞吹散后放置在-80 °C冰箱可保存一年；TRIzol具有腐蚀性，其含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶！
4. 在通风橱中向上步产物加入100 μl氯仿进行振荡混匀，室温静置5 min后，放 到预冷好的4 °C高速离心机中13,200 rpm离心10 min。
   注：注意离心机配平；氯仿有腐蚀性，使用前先分装到50 ml离心管中方便操作！
5. 离心结束后小心取出样品管，可见样品分为三层：上层透明的水层包含有RNA、中间的白色层包含DNA蛋白质和一些杂质、下层粉红色的有机层包含蛋白质、脂类等物质。小心将上层的水层转移至新的EP管中，加入等体积异丙醇进行沉淀，振荡混匀，室温静置5 min后，放到4 °C高速离心机中13,200 rpm离心10 min。
   注：吸取水层时注意不要吸到细胞杂质，宁缺毋滥；注意离心机配平；异丙醇使用前先分装到50 ml离心管中方便操作！
6. 离心结束后小心取出样品管，可见样品管底部出现一块白色沉淀，小心去掉上清，加入1 ml 75%乙醇进行漂洗。放到4 °C高速离心机中13,200 rpm离心2 min。
7. 小心去掉上清，加入1 ml 75%乙醇进行再次漂洗，再次放到4 °C高速离心机中 13,200 rpm离心2 min，用枪头吸去多余的液体。在通风橱中静置晾干，等到 白色沉淀变透明之前加入50-100 μl DEPC处理水进行溶解。
   注：去掉上清时，可以将样品管放在厨房纸上倒扣一下快速吸干管口残余液体。
8. 5 min后，白色沉淀完全溶解，用NanoDrop或者琼脂糖凝胶电泳法对提取的RNA 进行纯度鉴定，用NanoDrop或者Qubit进行浓度测定。

二、Dot-blot检测RNA样品中的m6A修饰
Dot-blot检测的原理是基于抗原抗体结合放大信号的检测方法，常用于检测DNA和RNA上的生物信号，相比于Western blot和Northern blot更加简便，不需要转膜和设计特异性的探针，只需要将定好量的核酸直接点到尼龙膜上经过交联即可加抗体孵育进行检测，原理如图1所示。具体操作如下：

1. 制备高纯度的RNA样品，进行浓度测定后，取500 ng用DEPC处理水定容到5 μl进行点样，5 μl样品液滴点样均质性比较稳定。
2. 点样前，需提前预热干式恒温器至70 °C，把干式恒温器的金属加热模块倒置，提供受热均匀的底板进行热交联。
3. 预热完毕后，裁剪大小合适的尼龙膜用透明胶带固定在96孔PCR管架上，膜面 向下倒扣在金属板面上，在对应的孔中点入对应样品。
4. 一次性吸取5 μl样品进行准确点样，点样完毕后在金属板面上静置热交联15 min。
   注：操作过程中不要移动点膜装置。
5. 待样品干透后去掉透明胶，用镊子把膜放到紫外交联仪中进行交联，按照总能量2000 KJ为单位进行交联，自动释放完能量即可，无需记时，再重复一次同样的，并尽量把膜靠近光源，可以用枪头盒架高。
6. 交联完成后，小心将膜的正面 (点样的一面) 转移到抗体孵育盒中，加入3% BSA (bovine serum albumin) 放置在水平摇床中室温封闭1 h或者4 °C封闭过夜。
7. 封闭完成之后，将膜放到含有1:2,000的3% BSA溶液稀释的m6A抗体的抗体孵 育盒中，室温进行一抗孵育2 h。
8. 用0.1% TBST洗膜3次，每次5 min。再用3% BSA溶液按照1:5,000的比例稀 释兔抗进行二抗孵育，室温孵育1 h。
9. 用0.1% TBST洗膜5次，每次5 min。
10. 沥干水后，按照1:1混匀化学显影液组分A和B，均匀滴在膜上孵育1 min，进行 显影检测。
11. 检测后，用0.1% TBST洗膜3次，每次5 min。
12. 加入1%亚甲蓝染液进行本底核酸染色，染色5 min后，用0.1% TBST漂洗至信 噪比降低，用白光进行检测。
    
    
    图1. A与m6A的化学式与dot-blot的检测原理

三、T3连接酶法检测RNA寡聚核苷酸链的m6A修饰
刘等人最先报道了一种基于RNaseH裂解特定单个m6A位点的定量方法，该方法需要位点特异性裂解和放射性标记，再进行连接辅助提取和薄层色谱分离 (SCARLET) (Liu et al., 2013)。虽然这个方法可以对m6A位点进行准确定量，但是多个酶的处理步骤和分离导致实验流程异常繁琐，需要一定的实验经验，况且该实验需要用到昂贵的试剂并且需要进行放射标记，使得该方法运用受到限制。最近，E. T. Kool等人鉴定了甲基敏感性的聚合酶Tth在进行延伸反应过程中可以区分A和m6A，影响了T碱基的掺入从而导致延伸阻碍 (Harcourt et al., 2013)。周等人也报道了Bst DNA聚合酶可以阻碍RNA引导的DNA合成 (Wang et al., 2016)。通过在DNA聚合酶中的探究，基于探针延伸来研究单个特定位点的m6A方法已经基本得到了建立。但是这些方法都需要放射标记或者荧光标记，而且这些方法的检测灵敏度还有所欠缺，由于缺少扩增的步骤使得低丰度的样品检测非常困难。这些方法对于A和m6A的区分度仅仅相差了十几倍，不足以检测各种复杂的样品。在此，我们介绍一种具有更高灵敏度的T3连接酶法来检测RNA的m6A修饰。具体操作如下：

1. 按照序列设计靶点左右两边的检测探针和PCR引物，如图2所示。
   注：探针L的5′端需要加磷酸修饰，探针R的3′末端两个脱氧核糖改为核糖 (Liu et al., 2018)。
2. 配置连接反应混合物A，进行探针退火。反应混合物A包括1 μl探针L (20 nM), 1 μl探针R (20 nM), 1 μl 10x T3连接缓冲液，以及1 μl RNA模板 (100-300 ng)，最后加DEPC处理水定容到9 μl，放进PCR仪中进行85 °C加热3 min。 反应结束后，在冰上静置。
   注：RNA需要先在85 °C加热3 min进行变性。
3. 配置连接反应混合物B，进行连接反应。经过条件测试，加入1 μl适量稀释的T3 DNA连接酶 (稀释10-50倍)，在35 °C孵育10 min后，放到PCR仪中65 °C 反应10 min失活连接酶。
   注：配置连接酶体系操作需要在冰上操作。
4. 取1 μl的连接产物，配置PCR体系。加入2x Taq mix、通用引物和连接产物， 用DEPC水定容至20 μl，放到PCR仪中扩增24个循环。
5. 往5 μl PCR样品中加入1 μl 6x DNA上样缓冲液混匀后上样到2.5%琼脂糖 凝胶中，在0.5x TAE缓冲液中恒压120 V电泳40 min，检测信号。
   
   
   图2. T3连接酶法检测m6A修饰示意图

四、MazF核酸内切酶法检测RNA 寡聚核苷酸链的m6A修饰
最近有报道称，一种来源于大肠杆菌毒素家族的RNA核糖核酸内切酶MazF对RNA中的ACA基序有甲基敏感性，能特异性地裂解未甲基化的ACA基序，而保持甲基化 (m6A) CA基序不被裂解 (图3)，因此可以用来鉴定m6A修饰的位点 (Imanishi et al., 2017)。具体操作如下：

1. 取10 pmol RNA oligo与2.5 U MazF酶和5x MazF buffer用DEPC处理水配置成20 μl反应体系，放入PCR仪中37 °C孵育30 min，反应后再65 °C反应10 min进行失活。
   注：RNA样品反应前需要先在85 °C加热3 min进行预变性。
2. 反应完后，取5 μl样品加入1 μl 6x DNA loading buffer混匀后上样到10%尿素-聚丙烯酰胺胶中，在0.5x TBE电泳缓冲液中恒压150 V电泳30 min，进行分 离鉴定。
   
   
   图3. MazF酶切RNA片段的原理图

结果与分析

一、哺乳动物细胞总RNA提取

1. 纯度分析
   1. 用NanoDrop对提取的RNA进行纯度鉴定
      RNA质检参数有OD₂₆₀/OD₂₈₀、OD₂₆₀/OD₂₃₀，它们的分别代表了不同的成分：260、280、230 nm下的吸光度分别代表了核酸、蛋白质、盐浓度和有机溶剂的值。A₂₃₀: 测定其它碳源物质，如酚，糖类等；A₂₆₀：核酸的吸收峰，用于检测RNA、DNA、引物等浓度；A280：蛋白质的吸收峰。一般来说，OD₂₆₀/OD₂₈₀ (Ratio，R) 在1.8-2.1范围内时，我们认为 RNA中蛋白的污染是可以容忍的，但是，用三羟甲基氨基甲烷 (Tris) 作为缓冲液检测吸光度时，R值可能会大于2 (一般应该是< 2.2的)。当R < 1.8时，溶液中蛋白的污染比较明显，可以根据自己的需要决定是否使用该RNA样品。当R > 2.2时，说明RNA已经水解成单核酸了。纯RNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值为2.0。
   2. 用1%琼脂糖凝胶电泳法对提取的RNA进行纯度和完整性鉴定
      真核生物的RNA在凝胶电泳时会呈现3条核糖体RNA的主带：28s、18s、5.8s (图4)。纯度高的RNA无多余的降解条带或者拖带现象，28s比18s一般为2：1，5.8s比较弱，发生降解的RNA的5.8s条带会出现明显聚集。如果出现比28s高的条带一般判断为基因组污染。如果出现了基因组污染，可以加入DNaseI进行消化处理；如果出现高位置拖带或者堵孔现象，原因可能是蛋白质或者盐离子污染，可以再次纯化去除杂质。
      
      
      图4. HEK293T细胞的RNA凝胶电泳图
      
      
      
2. 浓度分析
3. 完整性分析
   
   
   

二、Dot-blot检测m6A修饰
实验结果如图5所示，阴性对照组无信号，m6A修饰组信号明显，在亚甲蓝染色中显示两组点样量一致。如果抗体显色不明显，注意检查抗体的批次质量；如果背景过强，可以增加封闭的时间和洗膜的时间。如果亚甲蓝显色不明显，可以适当增加染色时间。


图5. Dot-blot检测m6A修饰的效果

三、T3连接酶法检测m6A修饰
经过核酸凝胶电泳检测的结果如图6所示，胶上面可见有三条主带，包括连接产物带，游离的探针和PCR引物带。在m6A修饰RNA oligo组中，无明显产物带，只有游离的探针和PCR引物带；在无m6A修饰RNA oligo组中，有明显的产物带，剩余少量的游离的探针和PCR引物。本实验针对每个位点的作用条件都不同，要根据使用模板、具体位点的序列来调整酶的反应浓度和反应时间等。


 图6. T3连接酶法检测m6A RNA oligo的结果

四、MazF核酸内切酶法检测m6A修饰
MazF酶切反应结果如图7所示，含有m6A修饰的RNA片段不能被MazF切开，而不含有m6A修饰的RNA片段能被MazF切开。由于RNA片段3'端带有FAM荧光基团修饰，所以在胶上显示出切下的剩余13 nt的条带。注意该实验要避免RNA酶的污染，如果是自己纯化的MazF蛋白，可以在体系中适当加入RNA酶抑制剂进行反应。


 图7. MazF酶切RNA片段的结果

溶液配方

1. 75%乙醇
   750 μl无水乙醇、250 μl DEPC处理水，两者混匀，现配现用。
2. 0.1%TBST：
   在500 ml 1x TBS中加入500 μl Tween-20，进行充分混匀后静置，等泡泡消失后 使用。
3. 3%BSA
   在100 ml 0.1% TBST中加入3 g BSA粉末，手动混匀后需要放在摇床上继续混 匀30 min，确保BSA中的细小颗粒充分溶解。
4. 1%亚甲蓝染液
   吸取1 ml 100x亚甲蓝染色加入99 ml DEPC处理水中进行混匀，静置后使用。
5. 2.5%琼脂糖凝胶
   称取1.25 g琼脂粉加入50 ml的0.5x TAE中，放入微波炉中进行融化，完全融化 后，等温度降到70 °C左右加入按照1:10000稀释的 gel-red核酸染料，再倒入 制胶槽中。
6. 10%尿素-聚丙烯酰胺胶
   在小烧杯中称取7.2 g尿素，加入7 ml DEPC处理水，放到磁力搅拌器上搅拌溶 解。再分别加入3.8 ml 5x TBE，4 ml 30%丙烯酰胺，120 μl 10% APS，16 μl TEMED，混匀后灌入制胶模具中。
7. 10% APS
   称取1 g APS粉末加入10 ml DEPC处理水中混匀，可分装成小管进行储存使 用，要放在4 °C中进行保存。
   

参考文献

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