产品说明书：KAPA独立双端标记接头试剂盒 Illumina^®平台   

适用说明：本文档适用于KAPA独立双端标记接头试剂盒（08861919702）、KAPA独立双端标记接头板（08861862001）和单独的KAPA接头稀释缓冲液（08278539001）。
友情提示：本文档包含原说明书中的产品描述，产品应用及实验操作流程、故障排查等主要信息，欲了解关于本产品详细说明及信息，建议参考原说明书 (点击面板上“下载PDF”可下载）。

产品描述

KAPA独立双端标记接头包括在基于连接的文库构建过程中使用的一组96个全长接头，用于Illumina®仪器上的测序。每个KAPA独立双端标记接头包含两个非重复的8个核苷酸标记（测序条形码），用于多重测序。这些接头适用于KAPA DNA和RNA文库制备试剂盒。

每个KAPA独立双端标记接头都是通过将两种寡核苷酸制成双链（杂交）制造的。这些寡核苷酸的骨架与Illumina TruSeq^®接头中使用的骨架相同，但KAPA独立双端标记接头中包含的样本标记序列为罗氏独有，并且与其他供应商采用的序列不同。表2（见原说明书）列出了192个非重复标记，组合后构成了96个独立双端标记接头。KAPA独立双端标记接头经过精心设计和配制，可确保高效的文库构建和低水平的接头二聚体形成，并有效减少了使用模块化流动槽和“Exclusion Amplification Chemistry”的Illumina测序仪上的标签错配（“标签跳跃”）有关的技术挑战¹。

试剂盒提供了KAPA接头稀释缓冲液[10 mM Tris-HCl，（pH 8.0-8.5），10 mM NaCl，1 mM EDTA]，以确保接头需要进一步稀释时处于最佳性能。

1. Illumina. Effects of Index Misassignment on Multiplexing and Downstream Analysis. 2017.
   
   

产品应用

KAPA独立双端标记接头用于对单个生物样本生成的测序文库进行独立的标记。这允许在靶向捕获或簇生成之前混合文库，以实现多重测序，这为广泛的应用简化了样本制备过程，且降低了下一代测序的成本。
用于Illumina平台的KAPA独立双端标记接头试剂盒的主要应用包括：

● 人类全基因组测序，特别是无PCR扩增的工作流程
● 使用SeqCap EZ HyperCap工作流程或其他杂交捕获系统（与兼容的Blocker结合使用）进行全外显子组或靶向测序
● RNA测序
● 染色质免疫共沉淀测序（ChIP-Seq）
● 其他直接的测序应用，例如，在兼容平台上做微生物全基因组测序

注意：KAPA独立双端标记接头不是甲基化的，因此不能用于甲基测序应用。

实验操作流程

1. 处理KAPA独立双端标记接头板的流程
   ● 重要！用于运输产品的箔膜不可刺穿，只能撕去。这是为了确保密封完整性，并且在运输过程中板不会泄漏。试剂盒中提供的三张替换用箔膜均可刺穿和撕去。
   ● 从包装套中取出接头板，在室温下或在合适的冷却试剂盘中解冻。完全解冻后置于冰上。
   ● 在移除密封盖之前，在室温下离心接头板（例如，在280 x g下离心1分钟）以确保所有液体都在孔的底部。
      注意：不要涡旋震荡接头板，因为它可能导致独立双端标记接头的交叉污染。在使用前，用移液器混匀各接头。
   ● 首次使用时，请小心取下箔膜，避免KAPA独立双端标记接头的交叉污染。丢弃原始箔膜，请勿重复使用。如果接头要用于需要可刺穿密封膜的自动液体处理系统，请使用试剂盒中包含的一张密封膜将板覆盖。
   ● 如果仅使用一部分KAPA独立双端标记接头，则首先使用无菌手术刀在箔膜上切一个口以移去所需的接头上的部分箔膜，小心的将箔膜整齐撕开，不要重复使用这部分密封膜。
   ● 根据实验需要，移去每个KAPA独立双端标记接头所需的体积。
   ● 如果您此时未使用板终全部的KAPA独立双端标记接头，请使用试剂盒中提供的一张全新的可刺穿/可撕下的粘性密封膜，确保箔膜正确对齐，并完全覆盖96个孔。使用滚筒或其他合适的工具确保密封膜平整地贴合。
   ● 将重新密封的KAPA独立双端标记接头板储存在-15 °C至-25 °C的恒温冰箱中并向上存放，以备后续使用。
   ● 试剂盒中提供了3张额外的可刺穿和可撕下的粘性密封箔膜（4titude PCR密封箔，目录号4ti-0550）。
   如有需要，可以订购额外的可替换密封膜，或者可以使用标准实验室库存中的任何其他合适的可刺穿/可撕下密封膜。
   
   
2. 与KAPA文库制备试剂盒兼容
   用于Illumina平台的KAPA双标记接头试剂盒可与以下文库构建试剂盒及工作流程结合使用：
   ● KAPA HyperPrep DNA文库构建试剂盒
   ● KAPA HyperPlus DNA文库构建试剂盒
   ● KAPA HTP和LTP DNA文库制备试剂盒
   ● 含RiboErase（HMR）或RiboErase（HMR）Globin的KAPA RNA HyperPrep文库构建试剂盒
   ● KAPA RNA和mRNA HyperPrep文库构建试剂盒
   ● 含RiboErase（HMR）或RiboErase（HMR）Globin的KAPA Stranded RNA-Seq文库构建试剂盒
   ● KAPA Stranded RNA-Seq文库构建试剂盒和mRNA-Seq文库构建试剂盒
   ● SeqCap EZ HyperCap工作流程
   
   
3. KAPA独立双端标记接头工作浓度
   对于绝大多数DNA应用，KAPA独立双端标记接头可按提供时的浓度使用，即工作浓度为15 μM。然而，低起始量DNA和绝大多数RNA-Seq文库需要进行单次稀释。
   
   接头浓度会影响连接效率，在连接后纯化过程中接头和接头-二聚体残留也会影响连接效率。需要摩尔过量的接头，以确保达到最佳的连接效率。
   
   较低的接头：插入片段摩尔比（接近2：1）会导致相当比例的插入片段分子仅有一端与接头连接，导致文库构建失败。
   
   当从不同起始量和片段长度构建文库时，请参阅特定KAPA文库制备试剂盒的技术数据表，了解推荐接头原液浓度；以及了解关于在特定应用中使用该特定试剂盒时，如何优化接头浓度的特定指南。
   
    对于KAPA HTP和LTP文库制备试剂盒，推荐的接头：插入片段摩尔比范围为10：1-40：1，而KAPA HyperPrep、KAPA HyperPlus试剂盒和KAPA RNA HyperPrep试剂盒可与高得多的比例兼容（≥ 100：1）。
   
   使用KAPA HyperPrep和KAPA HyperPlus试剂盒时，非常高的接头：插入片段摩尔比（200：1 - 1,000：1）可能有利于低起始量的文库构建。
   
   
   
4.  接头浓度计算
   ● 下述计算适用于DNA文库构建。对于RNA文库构建，接头原液浓度的计算仅基于起始量。
   ● 为了计算用于DNA文库构建的接头原液最佳工作浓度，必须首先计算出起始DNA的量（以pM为单位）。通过以下公式可完成：
   
   
   ● 接下来，通过将起始DNA的pM数乘以所需的接头：插入片段摩尔比，来计算所需接头的pM量。用于不同应用的接头：插入片段最优摩尔比，请参阅您的文库制备试剂盒随附的技术数据表。
   
   1. 随后将所需接头的pM量除以每次反应所用的接头体积，以获得所需的接头原液浓度（以μM/μl或pM/μl计）。
   ● 例如，片段大小为250 bp的200 ng起始DNA，表示1.21 pM的插入DNA。接头：插入片段摩尔比为10：1时，需要12.1 pM的接头。因此，当每次连接反应使用5 μl的接头原液时，需要的接头原液浓度为2.4 μM。
   ● 获取专为计算接头：插入片段摩尔比和原液浓度而设计的计算器，请访问www.sequencing.roche.com/support联系技术支持。
   
   
5. 稀释KAPA独立双端标记接头
   ● 为了在同一批处理的样本中适应不同的接头浓度，最好改变接头原液的浓度，并为每个接头分配固定的体积（如，5 μl）。不推荐使用替代方法（使用单一原液，并将不同体积的接头分配到连接反应中），这种方法也没法兼容于更高通量或自动化工作流程。
   ● 如有需要，使用试剂盒提供的KAPA接头稀释缓冲液[10 mM Tris-HCl（pH 8.0–8.5）、10 mM NaCl、1 mM EDTA]稀释KAPA独立双端标记接头。在任何其他缓冲液或PCR级水中稀释的接头，可能并不支持最佳的文库构建效率。
   ● KAPA独立双端标记接头板的每种接头含有超过标明的20 μl体积。由于这个原因，再加上稀释的接头不太稳定，所以不应在提供接头的板中直接稀释接头。
   ● 在新的板或管中，仅稀释当天使用所需的每个接头的量。不推荐将接头稀释液进行长期储存和多次冻融循环。
   ● 与KAPA独立双端标记接头板一起提供的密封箔可用于装有稀释接头的板。或者，也可以使用类似的密封箔。
   ● 对于准备构建的每批文库，制备适量的稀释接头。标准实验方法要求每个文库制备5 μl适当稀释的接头原液。
   
   1. 如果需要接头原液浓度>15 μM，则可以降低连接反应中的水的体积，并且将接头的体积增加到相同的程度，每次反应最多可加入10 μl接头。
   2. 每份稀释接头原液都需要超额的量，以确保准确的分配。与手动操作相比，自动化操作需要的超额量会更大。
      
      
6. 连接后延伸
   ●  在文库扩增或簇生成之前就从Illumina文库中去除过量的未连接接头和接头二聚体分子是非常重要的。这对于准备在采用模块化流动槽的Illumina仪器上测序的文库尤其重要。
   ●  请遵循技术数据表中针对您的KAPA文库制备试剂盒的连接后纯化指导说明。虽然使用KAPA纯化磁珠或Agencourt^® AMPure^® XP磁珠进行单次连接后纯化可去除大多数未连接的接头和接头二聚体（如KAPA HyperPrep和KAPA HyperPlus技术数据表中所推荐的），但可能需要进行第二次纯化或片段选择步骤，以去除任何来自文库的残留的接头种类。这对于无PCR的工作流程尤其重要，因为无PCR的工作流程不包括在扩增后纯化中去除未使用的接头或接头二聚体的过程。第一次纯化接头与接头二聚体的量，取决于连接反应中的文库构建化学法和接头浓度。
   ●  如果在接头连接后进行基于磁珠的片段选择，则必须首先进行单次连接后纯化（采用适当的磁珠：样本比；按照文库构建实验方法）。连接缓冲液含有高浓度的PEG 6000，这会影响从连接后片段选择中回收的文库片段的长度和分布。
   
   

使用过本产品的部分文献

1. O'Connell, C. M., Brochu, H., Girardi, J., Harrell, E., Jones, A., Darville, T., Sena, A. C. and Peng, X. (2019). Simultaneous profiling of sexually transmitted bacterial pathogens, microbiome, and concordant host response in cervical samples using whole transcriptome sequencing analysis. Microb Cell 6(3): 177-183.