小鼠乳腺干细胞流式分选   

材料与试剂

1.  平皿盖
2.  剪刀
3. 滤膜 (40 μm, 70 μm)
4. 胶原酶III (Worthington, catalog number: LS004183)
5. DNase I (Sigma-Aldrich, catalog number: D4263)
6. 胎牛血清 (HyClone, catalog number: SH30396.03)
7. 胶原蛋白酶3
8.  流式抗体来源及使用浓度 (表1)
   
       表1. 流式抗体来源及使用浓度
   
   
9. Trypsin-EDTA 0.05% phenol red (invitrogen, catalog number: 25300062)
10.  RPMI 1640培养液 (Gibco, catalog number: C1187550BT)
11.  DMEM高糖培养液 (Hyclone, catalog number: SH30243.01)
12. PBS
13. 消化缓冲液
14. DMEM培养基
15. 红细胞裂解液 (Sigma-Aldrich, catalog number: R7757)
16. PS双抗
    

仪器设备

1. 流式细胞仪FACSJazz (Becton Dickinson)
2. 细胞培养箱 (Esco)
3. 冷冻离心机 (Eppendorf)
4. 生物安全柜 (Esco)
5. 天平 (Sartorius)
6. 摇床 (Tensuc)
7. 水浴锅

实验步骤

一． 获取乳腺组织及消化

1. 配制组织消化缓冲液：在RPMI 1640培养液中，加入5%的胎牛血清，1%的PS双抗，25 mM HEPES (pH 8.0)。37 °C水浴锅中预热备用。
2. CO₂箱中安乐死小鼠。收取小鼠乳腺，PBS清洗后，放到6 cm平皿盖中，用剪刀剪碎组织至肉糜状，称取组织重量。
3. 按照每克乳腺组织10 ml消化液准备好消化缓冲液，放在50 ml离心管中 (不超过30 ml/管)。加入胶原蛋白酶3 (终浓度300 U/ml)。将剪碎的组织加入配好的消化缓冲液中，摇匀。。
   
4. 将装有组织的离心管平放在37 °C摇床中，100转/分钟，消化2 h，期间每15 min剧烈摇晃一次。组织充分消化后，消化液呈均一状态，无肉眼可见组织块，只有脂肪滴浮在液体表面。
   

二． 分离单细胞

1. 取出组织消化液，用常温的PBS补齐50 ml体积。201 × g，4 °C离心使细胞沉淀。离心时升速的加速度为9，降速的加速度为0或1, 离心5 min。
2. 去除上层脂肪及上清，加入1~2 ml红细胞裂解液，轻弹重悬沉淀，室温静置5 min。转移细胞到15 ml离心管中，加入PBS补齐15 ml。
3. 201 × g，4 °C离心离心5 min使细胞沉淀，吸除上清。加入2 ml预热的0.05% trypsin-EDTA重悬沉淀，37 °C培养箱中孵育5 min, 期间轻弹管壁一次使细胞更好地消化。此时会形成白色絮状细胞团，这是由于死亡细胞释放DNA导致的。
4. 加入2 ml预热的无血清DMEM培养基，再加入0.1 mg/ml 的DNase I，放在37 °C继续孵育5 min。期间，轻弹管壁使更多的单细胞释放出来。用10 ml含5%胎牛血清的PBS终止胰酶反应。
5. 将细胞通过70 μm滤膜过滤，去除细胞团块。201 × g，4 °C离心5 min，吸除上清；用预冷的5%的胎牛血清重悬沉淀 (大约每4个乳腺150~200 μl体积)，置于冰上备用。
   

三． 流式分选乳腺干细胞

1. 取出少量细胞进行单色抗体染色 (约50 μl)，用于FACS时做颜色补偿。剩余细胞加入一抗染色，冰上孵育20 min。期间轻弹细胞沉淀以使细胞能够充分染色。
2. 用含5%胎牛血清的PBS补齐15 ml体积后离心，吸除上清，用500~1,000 μl 5%的胎牛血清重悬沉淀，冰上孵育二抗20 min。
3. 离心，5%的胎牛血清重悬沉淀，通过40 μm滤膜过滤细胞，做好分选准备。
4. 进行流式分选，用含50%胎牛血清的PBS承接分选到的细胞。15 ml管中预放7~8 ml承接液。

结果与分析

如图1所示，在小鼠乳腺单细胞悬液中框取FSC较大的活细胞 (SSC选择log展示)。接着去掉粘连细胞，框取单细胞。在单细胞中选择CD31/CD45/Ter119阴性的细胞。根据CD24和CD29的表达框取luminal，basal和stroma细胞。Basal细胞为CD24⁺CD29^high的一群。根据之前的报道，乳腺干细胞特异性存在于basal细胞层中，在成年 (8w及以上) ICR品系的小鼠乳腺中占3%左右。


图1. 小鼠乳腺干细胞分选示意图

失败经验

如果存在单细胞得率低的情况，可以考虑从以下几点改进：

1. 第一步消化不够充分：组织在消化前可以剪得更碎一些；在消化过程中，可以更加剧烈地摇晃以使组织更加充分地消化。
2. 在胰酶和DNA酶处理时细胞损失：如果胰酶和DNA酶消化不够完全，可能导致细胞形成团块，留在滤膜上，从而减少单细胞得率。如果出现这种情况，可以适当增加处理的强度，可以用移液器吹打团块细胞，使更多的单细胞释放出来。
   
   

如果出现细胞分群不好的情况，可以考虑：

1. 单细胞少，很多细胞是由2~3个细胞组成的细胞团块。
2. 在加抗体孵育过程中，细胞过多形成沉淀。在冰上孵育时，应该过10分钟轻弹一次沉淀，使细胞能够更充分地染色。

溶液配方

1. 组织消化液：
   在RPMI 1640培养液，加入5%的胎牛血清，1%的PS双抗，25 mM HEPES (pH 8.0)。使用之前加入300 U/ml的胶原蛋白酶3
   

致谢

曾艺实验室的工作得到国家自然基金的支持。本文实验方案用于本实验室发表的文章 (Cai等, 2014; Wang等, 2015; Song等, 2019)。

参考文献

1. Cai, C., Yu, Q. C., Jiang, W., Liu, W., Song, W., Yu, H., Zhang, L., Yang, Y. and Zeng, Y. A. (2014). R-spondin1 is a novel hormone mediator for mammary stem cell self-renewal. Genes Dev 28: 2205-2218.
2. Song, W., Wang, R., Jiang, W., Yin, Q., Peng, G., Yang, R., Yu, Q. C., Chen, J., Li, J., Cheung, T. H., Jing, N. and Zeng, Y. A. (2019). Hormones induce the formation of luminal-derived basal cells in the mammary gland. Cell Res 29(3): 206-220.
3. Wang, D., Cai, C., Dong, X., Yu, Q. C., Zhang, X. O., Yang, L. and Zeng, Y. A. (2015). Identification of multipotent mammary stem cells by protein C receptor expression. Nature 517(7532): 81-84.