肿瘤微环境内巨噬细胞极化的流式检测方法   

金静思金静思*杨超杨超*邓刘福邓刘福  (*contributed equally to this work)
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摘要: 肿瘤的发生进展及治疗预后,与其赖以生存的肿瘤微环境息息相关。免疫细胞作为机体重要的监视防御力量,在肿瘤内部可能扮演着截然不同的角色。M2极化型的巨噬细胞呈现出免疫抑制状态,能够促进肿瘤发生,血管再生及转移 (Noy和Pollard,2014);而M1极化型巨噬细胞对抗肿瘤免疫效应有着关键作用 (Mantovani等,2017)。明晰肿瘤微环境内M1/M2巨噬细胞细胞的极化状态,对于研究肿瘤免疫治疗及预测临床预后有着重要的指导意义。本文旨在运用流式手段检测肿瘤微环境内巨噬细胞的极化状态,这是探究肿瘤相关巨噬细胞功能的重要内容之一。

关键词: 肿瘤相关巨噬细胞, 巨噬细胞极化, 肿瘤微环境, 流式技术

材料与试剂

材料:

  1.  眼科剪及眼科镊
  2. 1 ml移液枪及枪头
  3. 6孔细胞培养平底板 (NEST®, catalog number: 032819AA01)
  4. 96孔细胞培养U底板 (NEST®, catalog number: 112518AA03)
  5. 15 ml离心管 (Thermo Fisher Scientific, NuncTM, catalog number: 339650)
  6. 50ml离心管 (Thermo Fisher Scientific, NuncTM, catalog number: 339652)
  7. 无菌注射器 (上海康德莱企业发展有限公司,KDL®)
  8. 70 μm孔径滤网 (Corning, Falcon®, catalog number: 352350)
  9. 5 ml无菌圆底管 (带滤网) (Corning, Falcon®, catalog number: 352235)
试剂:
  1. 胎牛血清 (Gemini, FoundationTM, catalog number: 900-108)
  2. 胶原蛋白酶I (Worthington Biochemical®, catalog number: LS004186,-20°C储存)
  3. 脱氧核糖核酸酶I,来源于牛胰腺 (Sigma-Aldrich®,catalog number: DN25,-20°C储存)
  4. DMEM基础高糖培养液 (HycloneTM, catalog number: SH30243.01)
  5. PBS (HycloneTM, catalog number: SH302560.31)
  6. 乙醇
  7. 5% DMEM培养液 (见溶液配方)
  8. FACS buffer (见溶液配方)
  9. 肿瘤组织消化液 (见溶液配方)
抗体:
  1. Anti-FcR (CD16/CD32) (BioXCell, BioXCell, catalog number: BE0307)
  2. Fixable Viability Stain 780 (BD Bioscience,BD,catalog number: 565388)
  3. Anti-mouse-CD45.2-BV785 (Biolegend,catalog number: 109839)
  4. Anti-mouse-Ly6C-BV605 (Biolegend,catalog number: 128035)
  5. Anti-mouse-Ly6G-BV711 (Biolegend,catalog number: 127643)
  6. Anti-mouse-CD11b-PE/Cy7 (Biolegend,catalog number: 101216)
  7. Anti-mouse-F4/80-BV421 (Biolegend,catalog number: 123137)
  8. Anti-mouse-CD86-FITC (Biolegend,catalog number: 105005)
  9. Anti-mouse-MHC class II (I-A/I/E)-PerCP/Cy5.5 (Biolegend,catalog number: 107625)
  10. Anti-mouse-CD206-PE (Biolegend,catalog number: 141706)

仪器设备

  1. 37 °C二氧化碳培养箱 (Thermo Fisher Scientific)
  2. 电热恒温水槽 (上海一恒科学仪器有限公司, model: DK-8AXX)
  3. 低温离心机(Eppendorf®, model: 5810R)
  4. 微型台式真空泵GL-802B型 (Kylin-bell®, model: GL-802B型)
  5. Flow Cytometer (BD, model: LSRfortessa, or equivalent)
  6. 恒温细胞培养箱
  7. 超净工作台

实验步骤

  1. 前期准备工作
    1.1
    分组标记:根据实验分组需求取若干六孔板,标记荷瘤小鼠信息。六孔板中每孔加入3 ml DMEM高糖培养基,将六孔板置于冰上待用。
    1.2
    配制肿瘤组织消化液:将预先配制的100× 消化液母液 (含100 mg/ml胶原酶I和20 mg/ml DNA酶I) 用含5% FBS的DMEM高糖培养基稀释100倍,即最终工作浓度为1 mg/ml胶原酶I和200 μg/ml DNA酶I。将1× 消化液置于37 °C水浴锅预热待用。
    1.3
    器械准备:根据实验分组需求准备适量的剪刀镊子,用双蒸水洗净后75%乙醇消毒,烘干备用。
  2. 肿瘤组织的分离

采用颈椎脱臼法将荷瘤小鼠处死,喷洒75%乙醇消毒。左手持弯镊,右手持剪刀在肿瘤右侧1 cm处沿肿瘤边缘剪开一长约2 cm口子。左手捏住剪开处的皮肤向外翻折,可清晰见到肿瘤附着于皮下。用剪刀沿肿瘤边缘轻轻剪开,将肿瘤剥离,注意肿瘤若有溃烂,则避开溃烂之处。将剥离下来的肿瘤组织放入预先准备好的六孔板内。

  1. 肿瘤组织的剪碎

待全部肿瘤剥离完毕,用移液枪吸出预留DMEM高糖培养基,余大约0.1 ml,以免在剪碎过程中肿瘤组织干燥。手持剪刀小幅度高频率剪碎肿瘤组织,将肿瘤组织剪成泥浆状,肉眼无法看见清晰组织块。注意以上步骤均在冰上操作。

  1. 肿瘤组织的消化

将肿瘤组织剪成泥浆状后,每孔加入2 ml 1× 消化液,用1 ml枪头将肿瘤组织碎末打散,置于37 °C恒温细胞培养箱消化30 min,每隔10 min将六孔板取出晃动混匀一次。注意严格按照时间消化,以免影响免疫细胞活性;可根据肿瘤大小调整1× 消化液的用量。

  1. 制备肿瘤细胞悬液

消化完毕后,将六孔板取出放于冰板上,每孔加入4 ml DMEM高糖培养基 (含5% FBS) 终止消化。用巴氏吸管吸取肿瘤组织悬液至70 μm细胞滤网过滤,同时用1 ml注射器后部研磨遗留在滤网上的组织块 (注意研磨时切勿用力,易将脂肪等带入细胞悬液中),用DMEM高糖基础培养基冲洗滤网上的组织块,所得肿瘤悬液4 °C,850 x g,离心5 min。

  1. 染色前封闭

由于髓系细胞表面表达较多Fc受体,容易对流式抗体有非特异性结合,故采用预先阻断Fc受体封闭。离心后弃上清,根据沉淀多少加入适量FACS缓冲液混匀,取10 μl细胞悬液计数,将悬液细胞密度调至2 × 107个/ml。取100 μl细胞悬液于U底96孔内,按100:3比例加入抗Fc受体抗体 (即每100 μl细胞悬液加入3 μl抗Fc受体抗体),4 °C孵育30 min。

  1. 配制流式染色抗体

按照表1配制流式抗体混合液 (用FACS缓冲液配制),每孔加入70 μl流式抗体混合液,根据需要计算每个流式抗体所需体积。
注:由于F4/80、MHCII、CD86、CD206染色均显示漂移,没有明显分群,需要额外增加空白对照 (不加相应的流式抗体) 和荧光扣除对照 (加入与相应流式抗体一样的只带荧光的流式抗体)。以anti-mouse-CD206-PE为例,空白对照即不加CD206-PE这支流式抗体,而荧光扣除对照则是添加anti-rat-IgG-PE。


表1. 肿瘤微环境内MDSCs流式染色配色

注:流式抗体使用配色可自行调整,注意不要使用补偿过大的荧光通道。


  1. 流式染色

封闭结束后,4 °C,850 x g离心5min。弃上清,每孔加入70 μl流式抗体混合液,轻柔吹打混匀,注意不要有气泡。将96孔板置于4 °C避光,染色30 min。

  1. 洗涤、上机

染色结束后每孔加入200 μl FACS缓冲液,4 °C,850 x g离心5min。弃上清后再次加入200 μl FACS缓冲液洗涤一次,4 °C,850 x g离心5min。弃上清,加入300 μl FACS缓冲液重悬细胞,将细胞悬液转移至带滤网的流式管中 (同时过滤细胞悬液)。制备好的流式染色样品用BD Fortessa进行分析,数据处理软件采用FlowJo Version 10.0。

结果与分析

设门方式 (图1):
肿瘤相关巨噬细胞:Single cell, live, CD45+Ly6C-Ly6G-CD11b+F4/80+
M1巨噬细胞表面标志:MHCII,CD86
M2巨噬细胞表面标志:CD206

图1. 肿瘤相关巨噬细胞的设门方式

溶液配方

注:以下溶液均在超净台内配置。

  1. 5% DMEM培养液
    DMEM基础高糖培养液 + 5%胎牛血清
    4°C冷藏,1个月内使用
  2. FACS buffer
    PBS + 2%胎牛血清
    4 °C冷藏,1周内使用
  3. 肿瘤组织消化液
    5% DMEM培养液 + 胶原蛋白酶I (工作浓度:1 mg/ml) + 脱氧核糖核酸酶I (工作浓度:200 μg/ml)

参考文献

  1. Mantovani , A., Marchesi, F., Malesci, A., Laghi, L. and Allavena, P.(2017). Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology. Nat Rev Clin Oncol 14(7): 399-416.
  2. Noy, R. and Pollard, J. W. (2014). Tumor-associated macrophages: from mechanisms to therapy. Immunity 41(1): 49-61.
Copyright: © 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:金静思, 杨超, 邓刘福. (2019). 肿瘤微环境内巨噬细胞极化的流式检测方法. Bio-101: e1010311. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010311.
How to cite: Jin, J. S., Yang, C. and Deng, L. F. (2019). The Detection of Macrophage Polarization in the Tumor Microenvironment by Flow Cytometry. Bio-101: e1010311. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010311.
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