摘要:本研究方法是用软件Imaris建立果蝇脑区 (neuropil) 的三维模型,再根据建模结果,量化脑区及相关神经细胞的各种特征,以供后续分析并描述性状。本文以果蝇的嗅觉处理中枢—嗅叶 (antennal lobe) 为例,将免疫染色后的嗅小球 (glomeruli) 建模,如此既可量化个别嗅小球在空间分布的改变、沿着不同轴线的位移等,也能比较实验组与对照组的差异。本研究方法通过对脑区进行建模与量化分析,所获得分析结果不但可以了解神经细胞在特定脑区的分布情形,也能了解特定神经细胞发生变异时对于脑区结构的可能影响,并有助于量化神经组织的细微变化。
关键词: 果蝇 (Drosophila), 嗅叶 (antennal lobe), 三维建模 (3D reconstruction), 性状分析 (phenotype analysis), 大脑 (brain), 神经细胞 (neuron)
材料与试剂
仪器设备
软件
实验步骤
免疫荧光染色标定的神经组织样本制备
果蝇大脑三维建模及分析
神经细胞的形态 (morphology) 是建构神经网路的基础,因此,了解其轴突 (axons) 及树突 (dendrites) 的分布形态,发育规律及调控方式,有助于了解神经连结网路的形成及讯息传递的途径。为了解神经细胞的发育、形态,及神经回路的形成,研究人员经常在神经细胞中表达荧光蛋白 (fluorescent protein) 来标记其结构,但常见的问题是同时标记的神经细胞数目太多,且来自不同细胞的神经突 (neurite) 会混杂在一起,难以区分来源。即使重建了个别神经细胞,但要进行个体间的比较,仍须建造标准脑模型 (standard brain),使来自不同个体的神经细胞及脑区能对应到标准脑的位置 (Chiang等,2011;Peng等,2011;Ito等,2014;Panser等,2016;Costa等,2016;Dolan等,2018)。这些方法的前提是研究者必须收集全脑影像,因此增加了工作量与难度。本研究方法通过直接将脑中的特定脑区建模后,再量化被标记神经细胞的特征,如:树突所分布的区域以及局部密度等。以果蝇的嗅叶 (antennal lobe) 为例,其内部可依据形态与边界划分出55个不同的子区域—嗅小球 (glomerulus),而手动建模后可取得不同的量化特征值,供研究人员进行量化分析。当研究人员欲观察以荧光蛋白标记的区域中介神经元 (local interneurons) 时,只需收集嗅叶和邻近脑区的影像,便可量化描述该群神经细胞和嗅小球在不同果蝇脑中的差异。 一、影像建模 影像建模的目的在于量化我们需要观察的样本特征,后续便能系统化地分析。在此我们以果蝇脑中的嗅叶示范如何建模。为了减少建模过程中所造成的人为判读偏差,我们从实验组与对照组各选10个标定的果蝇大脑交给第一位实验者混合并随机排序,之后再由第二位实验者在单盲试验下进行人工建模,建模的结果会再交由第一位实验者解盲以分开实验组与对照组,再行分析。以下为果蝇嗅叶及部分脑区三维建模的技术流程,如果要分析其他脑区或果蝇的其他身体结构,也可参考以下方式建模:
二、资料分析 在我们的建模资料中,嗅叶、蕈形体和嗅小球主要有十项特征被用于后续分析,其分别是表面积 (area)、与原点的距离 (distance from origin reference frame)、二种椭圆率 (oblate ellipticity, prolate ellipticity)、脑区内平均荧光表现强度 (intensity mean)、在X、Y、Z轴向上的位置 (position x reference frame, position y reference frame and position z reference frame)、圆率 (sphericity) 以及体积 (volume)。为了让不同果蝇大脑的同一嗅小球可以相互比较,除了椭圆率和圆率,每一果蝇脑的各嗅小球特征必须先做标准化 (standardize),再做后续分析。
针对脑区影像建模后能得脑区的圆率、椭圆率、几何中心位置、该区的荧光强度等量化参数,因此能以更精确的分析去比较实验组与对照组的异同,并可采用多变数类型的分析方式 (例如主成分分析)。再加上计算不同脑区间的相对距离,这些分析均有助于了解操控的实验条件是否会影响特定脑区 (间) 的结构改变以及标定的神经细胞在该脑区的可能变化。藉由建模以及后续的量化分析,研究者将能更精确地描述研究的性状。以我们的研究为例 (Liou等,2018),若是单以肉眼判断,无法有效地客观判断、分析荧光蛋白所标定的区域中介神经元对嗅小球的影响,相较之下,嗅小球的几何中心位置分析能提供量化的差异,这正是本建模方式的特点。本建模方法也适用不同生物体的脑区与其他组织,故可供不同领域的研究者进行性状的量化分析与比较。 图2. 嗅小球建模后的数据分析图. A. 对嗅小球的量化特征进行主成分分析后,将第一主成分 (Principal Component 1) 和第二主成分 (Principal Component 2) 以视觉化呈现个别嗅小球在主成分分析后的空间分布图。本图中实验组和对照组果蝇的嗅小球分别以绿色和黑色的数据点标示。B. 左图呈现实验组 (绿色) 和对照组 (黑色) 的嗅小球在Y轴上的位置。数据点所代表的是平均位置 (mean),并以误差线标示标准差 (standard deviation) 的范围。其中嗅小球的排序是根据对照组嗅小球在Y轴的平均位置由大到小排序。中图呈现实验组与对照组的嗅小球在Y轴的平均位置差距 (实验组减去对照组)。黑线代表整体嗅小球在Y轴位置差距上的平均值,灰线表示标准差的范围。红色数据点代表该嗅小球的Y轴位置差距大于平均值加上一倍标准差,橘色代表该嗅小球的Y轴位置差距小于平均值减去一倍标准差,介于其间的嗅小球则标以黑色。此处的嗅小球排序与左图相同。右图将中图的红色和橘色数据点所对应的嗅小球标示到对照组果蝇的嗅叶,以视觉化呈现位置差距较大的嗅小球的位置。C. (C1) 呈现在实验组与对照组中嗅小球之间的平均距离。(C2) 呈现两组的平均距离差值 (实验组减去对照组)。实验组的嗅小球间平均距离大致上远于对照组果蝇的嗅小球 (红色区域),但仍有部分嗅小球间的距离在实验组中拉近 (蓝色区域)。此处的嗅小球索引与左图相同。D. 左图中,在对照组果蝇的嗅叶标示的三个嗅小球DA1、VA1d和DC3 (绿色区域) 为Mz19所标定的神经元树突涵盖的区域。右图呈现Mz19所标定的神经元树突在三个嗅小球内的平均荧光表现强度,其中黑色数据点代表对照组,绿色数据点代表实验组。图2中实验组与对照组的分析样本各为5个嗅叶,皆取自Liou等 (2018) 中的部份样本并重新分析。
失败经验
如果建模过程发生问题,发现建立的脑区模型形状有不完整或变形的情况 (图1C),则可能有以下状况:
溶液配方
致谢
本研究方法首先于Liou和Lin等人 (2018) 描述,感谢所有参与此研究工作的人员。感谢杨己任与张颢馨于本文撰写过程所提供的宝贵建议。本研究方法是由中央研究院前瞻计划 (AS-102-CDA-L02) 经费支持。本研究方法无任何利益冲突或竞争性利益。
参考文献
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