Search

生长素极性运输速率检测方法   

How to cite Favorites Q&A Share your feedback Cited by

Original research article

A brief version of this protocol appeared in:
Rice Protocol e-book

实验原理:生长素极性运输在植物发育过程中发挥有非常重要的作用。在地上部分,生长素由顶端合成向基部运输,因此可以在茎杆顶端施加同位素H3标记的IAA,然后一定时间后检测另一端的同位素H3信号,从而可以评价生长素运输的速率。
实验目的:检测植物体内生长素极性运输的速率。

关键词: 生长素, 极性运输, 速率测定

材料与试剂

  1. 1.5 ml管子
  2. 滤纸
  3. 记号笔
  4. 水稻植株
  5. H3标记的IAA (Amersham, catalog number: TRK-781)
  6. Phytogel
  7. 生长素极性运输抑制剂TIBA (Sigma, catalog number: T5910)
  8. 液闪缓冲液 (见溶液配方)
  9. ½ MS液体培养基 (见溶液配方)
  10. ½ MS固体培养基 (见溶液配方)

仪器设备

  1. 液闪仪
  2. 摇床

实验步骤

  1. 取水稻抽穗期的第一节间,截取底端2 cm,每0.5 cm标记一次 (一定要严格区分顶端和底端),放入½ MS液体培养基(pH 5.8)中于摇床上, 100 rpm, 2 h以脱去内源的生长素。
  2. 用滤纸吸干后,将顶端和底端 (分别测量向基和向顶运输能力) 插入预先准备的20 μl含有100 nM的H3-IAA和0.35% phytogel的½ MS固体培养基中(1.5 ml管子),盖好盖子。
  3. 向基运输做两组,一组正常进行,另外一组,在½ MS固体培养基中还加入10 μM的TIBA。
  4. 上述处理材料在室温下暗处理3 h,然后从未插入培养基的另外一端截取0.5 cm长的茎秆片段,用½ MS液体培养基洗两次(15 min每次),放入2 ml液闪液中漂洗16~24 h,用液闪仪测量放射强度,按照参考文献中的计算方法将信号值转换为运输速度 (Lewis and Muday, 2009)。

注意事项

  1. 在脱去内源生长素的时候,要保证茎杆为垂直向上在摇床上慢摇。
  2. 所用材料不宜过老。
  3. 必须做向顶运输的对照,以排除检测到的信号值是因为IAA在茎杆中自由扩散而产生的。
  4. H3为辐射距离非常短的同位素类型,且释放的是高速运动电子,不会穿透人体,但是必须保证不能跟皮肤直接接触,否则会因为潜在的内照射而不安全。H3的半衰期长达12年以上,因此实验过程中产生的所有废料必须妥善的处置。

溶液配方

  1. ½ MS液体培养基,pH 5.8 
    先配制母液:
    1)
    MSmax solution
    NH4NO3
    16.5 g/L
    KNO3
    19.0 g/L
    KH2PO4
    1.7 g/L
    MgSO4·7H2O
    3.7 g/L
    CaCl2·2H2O
    4.4 g/L
    2)
    MSmin solution
    KI
    0.083 g/L
    H3BO3
    0.62 g/L
    MnSO4·4H2O
    2.23 g/L
    ZnSO4·7H2O
    0.86 g/L
    Na2MoO4·2H2O
    0.025 g/L
    CuSO4·5H2O
    0.0025 g/L
    CoCl2·6H2O
    0.0025 g/L
    3)
    ½ MS液体培养基配制
    取50 ml MSmax solution和5 ml MSmin solution,加入800 ml H2O,用1 M KOH调节pH到5.8,定容到1 L。
  2. ½ MS固体培养基
    在½ MS液体培养基中加入Phytagel 3.5 g/L加热融化后即得½ MS固体培养基。
  3. 液闪缓冲液
    (2,5-二苯基恶唑) (PPO) 5 g/L;1, 4-双-(4’-甲基-5-苯基恶唑) (POPOP) 0.2 g/L,用甲苯溶解。

参考文献

  1. Lewis, D. R. and Muday, G. K. (2009). Measurement of auxin transport in Arabidopsis thaliana. Nat Protoc 4(4): 437-451.
Copyright: © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:王磊, 和玉兵, 欧阳亦聃. (2018). 生长素极性运输速率检测方法. Bio-101: e1010173. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010173.
How to cite: Wang, L., He, Y. B. and Ouyang, Y. D. (2018). A Protocol to Determin Auxin Polar Transport Tate. Bio-101: e1010173. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010173.
Q&A

Please login to post your questions/comments. Your questions will be directed to the authors of the protocol. The authors will be requested to answer your questions at their earliest convenience. Once your questions are answered, you will be informed using the email address that you register with bio-protocol.
You are highly recommended to post your data including images for the troubleshooting.

You are highly recommended to post your data (images or even videos) for the troubleshooting. For uploading videos, you may need a Google account because Bio-protocol uses YouTube to host videos.