活性氧检测   

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Original research article

A brief version of this protocol appeared in:
Rice Protocol e-book

第一部分:NBT染色检测超氧阴离子(O2-)

实验原理:氮蓝四唑 (NBT, nitroblue tetrazolium) 与超氧阴离子发生反应并形成蓝色的甲臢 (formazan)。
实验目的:定性、原位检测水稻各组织中的超氧阴离子(O2-)。

关键词: 活性氧, 氮蓝四唑, 超氧阴离子, 水稻, 生理指标

材料与试剂

  1. 50 ml离心管
  2. 10 ml离心管
  3. 氮蓝四唑NBT (Sigma, USA, CAS: N5514)
  4. 叠氮化钠 (Sigma, USA, CAS: S8032)
  5. 1 M 磷酸缓冲液 (pH 7.8)
  6. 95%乙醇
  7. 1 M叠氮化钠溶液 (见溶液配方)
  8. NBT染液 (见溶液配方)

仪器设备

  1. 真空干燥箱
  2. 水浴锅

实验步骤

  1. 配制NBT染液(见溶液配方)并分装入50 ml离心管。
  2. 用剪刀剪取水稻叶片或其他组织,立刻放入装有NBT染液的50 ml离心管中。
  3. 将离心管放入真空干燥箱内,打开管盖。关闭真空干燥箱门和排气口,打开真空泵抽出箱内空气,待负压表读数降至-0.1 MPa时关闭真空泵,保持负压30 min。
  4. 打开排气口,恢复箱内气压,待气压稳定后取出离心管,于室温(25 °C)静置60 min。
  5. 倒弃NBT染液,加入95%乙醇并浸没样品,将离心管置于80 °C水浴中脱色,每隔10min换一次95%乙醇,待样品的绿色全部褪去后将样品取出拍照记录染色结果。

溶液配方

  1. 1 M叠氮化钠溶液
    称取0.6501 g叠氮化钠固体于10 ml离心管中,加入ddH2O定容至10 ml
  2. NBT染液
    称取0.05 g NBT于50 ml离心管中,加入500 μl 1 M叠氮化钠溶液和500 μl 1 M 磷酸缓冲液(pH 7.8),加入ddH2O定容至50 ml


第二部分:DAB染色检测过氧化氢

实验原理:当过氧化物酶存在时,二氨基联苯胺 (3,3’-diaminobenzidine, DAB) 被双氧水氧化生成不溶于水的暗棕色颗粒。
实验目的:定性、原位检测水稻各组织中的双氧水.
关键词:水稻,生理指标,活性氧,过氧化氢,二氨基联苯胺

材料与试剂

  1. DAB (Sigma, USA, CAS: D8001)
  2. 95%乙醇
  3. 0.2 M HCl
  4. DAB染液 (见溶液配方)

仪器设备

  1. 真空干燥箱
  2. 水浴锅

实验步骤

  1. 配制DAB染液 (见溶液配方),将离体的叶片浸入DAB染液。
  2. 抽真空30分钟,使得叶片完全浸入DAB染液中。
  3. 室温孵育过夜。
  4. 用95%乙醇在80 °C水浴中脱色,拍照。

注意事项

NBT染色和DAB染色时,需注意取样部位的不同对定性结果造成的影响。例如,对不同胁迫环境下的同一批植株进行取样,最好取生长时期相同的植株上相同部位的叶片染色进行比较。

溶液配方

  1. DAB染液
    在50 ml离心管中加入20 mg DAB和38 ml ddH2O (或Tris-acetate buffer, pH 5.0),0.2 M HCl调pH至以便DAB溶解,配成终浓度为0.5 mg/ml的DAB染液。
    注:DAB染液现配现用,避免自我氧化。


第三部分:过氧化氢定量测定

实验原理:当过氧化物酶存在时,过氧化氢和10-乙酰基-3,7-二羟基吩嗪(10-Acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine, ADHP)在过氧化物酶催化下产生荧光产物试卤灵(resorufin)。用酶标仪对试卤灵进行测定可计算出过氧化氢的含量。
实验目的:定量测定水稻各组织中过氧化氢含量。
关键词:水稻,生理指标,过氧化氢

材料与试剂

  1. 1.5 ml 离心管
  2. 液氮 (湖北省畜牧局制氧厂)
  3. 20 mM 磷酸缓冲液,pH 6.5
  4. Amplex Red hydrogen peroxide/peroxidase assay kit (Molecular Probes, USA, CAS: A22188)

仪器设备

  1. 离心机
  2. 多功能酶标仪 (M200, Tecan, Mechelen, Belgium)
  3. 酶标板

实验步骤

  1. 水稻样品用液氮研磨,取0.1 g样品至1.5 ml离心管中,立即加入1 ml 4 °C预冷的20 mM磷酸缓冲液(pH 6.5),充分震荡混匀。
  2. 12,000 rpm低温4 °C离心10 min,上清液转入新的离心管中用于后续实验。
  3. 按照试剂盒Amplex Red hydrogen peroxide/peroxidase assay kit (Molecular Probes)提供的方法对过氧化氢进行定量测定。
Copyright: © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:游均, 方玉洁, 熊立仲. (2018). 活性氧检测. Bio-101: e1010170. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010170.
How to cite: You, J., Fang, Y. J. and Xiong, L. Z. (2018). Reactive Oxygen Detection. Bio-101: e1010170. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010170.
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