Chromosome Observation at Microspore Meiosis Stage Using Squash Technique in Rice   

材料与试剂

1. 载玻片
   
2. 盖玻片
   
3. 液氮
   
4. 乙醇
   
5. 乙酸
   
6. 洋红染料
   
7. Acetic acid
   
8. FeCl₃
   
9. 含DAPI的封片剂，Vectashield (Vector Labs, catalog number: H-1200)
   
10. 卡诺固定液 (见溶液配方)
    
11. 醋酸洋红溶液 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 解剖针
   
2. 手术刀
   
3. 染缸（体积约40 ml）
   
4. 荧光显微镜 (Leica DM4000B with CCD camera Leica DFC480)
   

实验步骤

1. 田间采集时期适当的幼穗，用卡诺固定液固定3小时。
   
2. 在处理过的载玻片上(注)滴一滴固定液，取10朵处于减数分裂时期的小花，用解剖针在载玻片上捣碎后去掉大的组织碎片，加一滴醋酸洋红染色。
   
3. 将载玻片在酒精灯上烘烤瞬间(玻片不可烘干)，再加一滴醋酸洋红后，盖上盖玻片。
   
4. 压片，去除多余液体，注意不要使载玻片和盖玻片水平移动。
   
5. 液氮浸泡载玻片5 min，用手术刀揭去盖玻片。
   
6. 依次经70%、90%、100%酒精梯度脱水，每次5 min。
   
7. 取出载玻片，晾干，在载玻片上加20 μl含DAPI的封片剂，盖上盖玻片。
   
8. 荧光显微镜下观察(340 nm激发，480 nm发射，如图1)。
   
   
   图1. 野生型水稻小孢子母细胞减数分裂不同时期染色体形态。A. Leptotene; B. Zygotene; C. Pachytene; D. Early Diakinesis;
   E. Late Diakinesis; F. Metaphase I; G. Anaphase I; H. Telophase II. Scale bars = 5 μm.
   

注意事项

1. 将盖玻片和载玻片在肥皂水中沸浴5-10 min。清水冲洗后，让水滴流干。
   
2. 在2%的盐酸酒精 (95%酒精100份加入浓盐酸2份) 中浸泡3-5小时，再用流水冲洗，让水滴流干，浸入95%酒精中，捞片擦干。
   

溶液配方

1. 卡诺固定液
   乙醇:乙酸=3:1，体积比
   
2. 醋酸洋红溶液
   0.5 g洋红染料溶解到100 ml煮沸的45% acetic acid中，再加几滴FeCl₃至深红色