震动切片   

材料与试剂

1. 载玻片
   
2. 盖玻片
   
3. 双面剃须刀片、单面刀片 (SUPER THIN DOUBLE EDGE RAZOR STAINLESS STEEL BLADES, Gillette)
   
4. 样品台
   
5. 琼脂糖 [BIOWEST AGAROSE, catalog number: 111760; Gene tech (shanghai)]
   
6. 透明剂 (见溶液配方)
   

仪器设备

1. Leica VT1200S振动切片机
   
2. 显微镜
   

实验步骤

1. 包埋 (视频1) ：将新鲜活体组织或固定过的组织包埋在低熔点石蜡或10%的低熔点琼脂糖中；对温度不敏感的样品，也可以包埋在普通琼脂糖(3-6%)中。
   
   
   
   视频1. 样品组织琼脂糖包埋
   
   
2. 修块 (视频2)：待琼脂糖冷却凝固后，对样品进行修块，使样品待切割面与修块上平面平行。最好将包埋块修成梯形，包埋块底座面积较大有利于样品牢固的粘合在样品台上。
   
   
   
   视频2. 琼脂糖包埋样品修块
   
   
3. 切片 (视频3)：取出样品台并擦干，将样品包埋块粘 (502强力胶迅速粘黏) 到目标放置部位，强力胶干燥 (防止包埋块粘黏不牢脱落以及防止未干燥胶屑浮于水面污染切片) 后复位样品台并调整好样品方向。
   
   
   
   视频3. 琼脂糖包埋样品切片
   
   
   3.1

   在缓冲托盘中加入清水并覆盖住包埋块。安装双面剃须刀片到刀架上，通过工具拧紧上方控制刀片的螺丝，右侧面调整刀架角度 (使得刀片平行于包埋块上底面) (视频4)。
   
   

   

   视频4. 切片机刀片调节

   
   
   3.2

   控制面板上的DOWN和UP按钮用于调整样品台的高度；刀头控制按钮(标有向上或向下箭头图标)，可用来调节刀的前后移动。降低样品台高度使得刀片与包埋块上底面在一个平面上，向前移动刀架，使刀片停在包埋块前方，开始设置切片参数 (见步骤3.1、3.2及3.3) (视频5)。
   
   

   

   视频5. 切片机参数设置

   
   
   3.3

   控制面板的屏幕上显示了四个平时常用的数据：切片速度mm/s、振幅mm、切片厚度μm以及切片总厚度∑μm。当选定SPEED后，该按键指示灯亮，通过面板上部旋钮可以调节刀头的前进速度 (0-1.5 mm/sec)，旋钮顺时针方向为数值增大，逆时针方向为减小。当选定AMPL后，可以调节刀头振幅(0-3 mm，操作同SPEED)。当选定AUTO FEED时，可调节切片厚度(0-1000 μm)，调节STEP SIZE (1 μm，10 μm及100 μm) 选择调整数字的单位，转动旋钮调整数字大小。
   
   3.4

   通过AUTO/MAN进行切片自动或手动模式选择，该按键的右上角指示灯亮为自动切片，左下角指示灯亮为手动切片。通过SINGLE/CONT按钮选择单张切片或连续切片模式。一般选择自动切片及连续切片模式。
   
   3.5

   以自动切片模式为例，降低样品台高度，使刀片高于包埋块，按动标向下黑三角图标的按钮，记录刀头移动的起始位置，灯亮后，向前移动刀架至结束位置，按下向上黑三角图标的按钮，记录结束位置。按RUN/STOP按钮开始震动切片；在这期间，可按PAUSE键立即停止切片，捞取需要的切片暂置于所需缓冲液中 (例如水或者PBS中)，再按一次即可启动继续切片；正在切片时，按RUN/STOP按钮，刀片不会立即停止，而是移动到最前端再返回起始位点后才停止切片。(视频6)
   
   

   

   视频6. 自动模式下震动切片

   
   
   3.6

   在手动切片模式下，按RUN/STOP按钮开始震动切片，刀头移动到最前端就自动停止，而不会返回到起始位点；在此期间按PAUSE，切片机无响应。
   
   
4. 镜检：将切片转移到载玻片上，同时加一滴水在切片上 (防止片子脱水，破坏组织结构)，并盖上盖玻片，在显微镜下镜检拍照。压片时，在样品上滴加透明剂可能会提高镜检效果。
   
5. 清理：切片完毕，关闭切片机开关；及时将双面刀片取下；清理样片台上的粘合剂及残留样本；清洗刀架、样品台和冰浴槽等物件；最后做好仪器使用登记。
   

注意事项

1. 包埋时，一定要等琼脂糖水溶液冷却到50-60 °C左右时再进行操作(低熔点琼脂糖可以冷却到更低温度)，以免温度过高损伤样品。样品数目多或包埋的工作量较大时，可将包埋容器放到50-60 °C的烘片台上进行保温，以延缓琼脂糖的冷却时间。琼脂糖凝固过程中不要反复移动组织，防止切片时发生组织脱落。
   
2. 切片时，有两种办法捞取切片：
   一是调节切片机自动连续切片，等切完整个材料后再从水中捞取目的切片到载玻片上。这样做的优点是操作者不易疲劳；缺点是更换下一个样品时要清洗刀头、样品台和缓冲托盘等物件，以防样品污染。
   另一种方法是将切出的每一张切片及时转移到载玻片上，这样可以排除样品污染。如果担心切片落入周围水中不方便捞片(有的切片在水中不易寻找)，可以等样品已切好而琼脂块还未切断时，按控制面板上的PAUSE键停止切片。此时切片有一部分与琼脂块相连，用镊子夹取切片转移到载玻片上即可。
   
3. 包埋剂的硬度、刀片状态(锋利，表面清洁，没有缺口等)、刀片角度、切片速度、切片厚度和刀头振幅等都会影响到切片的质量。不同组织的切片，对上述参数会有不同要求，需多次试验，以达到最佳效果。如硬度较高的样品最好使用浓度较大的琼脂糖包埋，甚至不用包埋直接切片，同时还可采用较高的刀片移动速度；另外，硬度高的样品(如水稻茎干等)，建议进行徒手切片。
   
4. 切片时一定注意安全，严防刀片伤到自己。比如，一定要先将样品安装好后再装上刀片开始切片，同时切片完毕先取下刀片再更换样品或清理样品台；刀片一定要在刀架上拧紧，以防切片时刀片飞出伤人。
   
5. 震动切片的优点是简单快速，可以做活体切片，利于组织化学或免疫组织化学染色；也有许多缺点，如切片较厚(10-500 μm左右)，分辨率较差，切片标本不易长期保存等。一般震动切片的厚度为80-100 μm为最适厚度。
   
6. 以上只是常规制样的切片流程，关于切片机构造及相关更详细的操作，请参考切片机说明书。

溶液配方

1. 透明剂

   常用配方：
   水合氯醛	8 g
   ddH2O	3 ml
   丙三醇	1 ml
   其他配方：
   水合氯醛	10 g
   ddH2O	3 ml
   丙三醇	2 ml