震动切片   

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Original research article

A brief version of this protocol appeared in:
Rice Protocol e-book

实验原理:切片技术是对动植物组织结构进行精细观察的重要手段之一。震动切片主要通过精密的步进机构,并配合往复运动刀片的切削动作,快速简单的获得组织切片。
实验目的:快速简单的获得组织切片,进而用于常规组织化学及细胞结构的光镜水平研究。

关键词: 切片, 快速, 活体样本, 琼脂糖

材料与试剂

  1. 载玻片
  2. 盖玻片
  3. 双面剃须刀片、单面刀片 (SUPER THIN DOUBLE EDGE RAZOR STAINLESS STEEL BLADES, Gillette)
  4. 样品台
  5. 琼脂糖 [BIOWEST AGAROSE, catalog number: 111760; Gene tech (shanghai)]
  6. 透明剂 (见溶液配方)

仪器设备

  1. Leica VT1200S振动切片机
  2. 显微镜

实验步骤

  1. 包埋 (视频1) :将新鲜活体组织或固定过的组织包埋在低熔点石蜡或10%的低熔点琼脂糖中;对温度不敏感的样品,也可以包埋在普通琼脂糖(3-6%)中。

    视频1. 样品组织琼脂糖包埋

  2. 修块 (视频2):待琼脂糖冷却凝固后,对样品进行修块,使样品待切割面与修块上平面平行。最好将包埋块修成梯形,包埋块底座面积较大有利于样品牢固的粘合在样品台上。

    视频2. 琼脂糖包埋样品修块

  3. 切片 (视频3):取出样品台并擦干,将样品包埋块粘 (502强力胶迅速粘黏) 到目标放置部位,强力胶干燥 (防止包埋块粘黏不牢脱落以及防止未干燥胶屑浮于水面污染切片) 后复位样品台并调整好样品方向。

    视频3. 琼脂糖包埋样品切片

    3.1
    在缓冲托盘中加入清水并覆盖住包埋块。安装双面剃须刀片到刀架上,通过工具拧紧上方控制刀片的螺丝,右侧面调整刀架角度 (使得刀片平行于包埋块上底面) (视频4)。

    视频4. 切片机刀片调节

    3.2
    控制面板上的DOWN和UP按钮用于调整样品台的高度;刀头控制按钮(标有向上或向下箭头图标),可用来调节刀的前后移动。降低样品台高度使得刀片与包埋块上底面在一个平面上,向前移动刀架,使刀片停在包埋块前方,开始设置切片参数 (见步骤3.1、3.2及3.3) (视频5)。

    视频5. 切片机参数设置

    3.3
    控制面板的屏幕上显示了四个平时常用的数据:切片速度mm/s、振幅mm、切片厚度μm以及切片总厚度∑μm。当选定SPEED后,该按键指示灯亮,通过面板上部旋钮可以调节刀头的前进速度 (0-1.5 mm/sec),旋钮顺时针方向为数值增大,逆时针方向为减小。当选定AMPL后,可以调节刀头振幅(0-3 mm,操作同SPEED)。当选定AUTO FEED时,可调节切片厚度(0-1000 μm),调节STEP SIZE (1 μm,10 μm及100 μm) 选择调整数字的单位,转动旋钮调整数字大小。
    3.4
    通过AUTO/MAN进行切片自动或手动模式选择,该按键的右上角指示灯亮为自动切片,左下角指示灯亮为手动切片。通过SINGLE/CONT按钮选择单张切片或连续切片模式。一般选择自动切片及连续切片模式。
    3.5
    以自动切片模式为例,降低样品台高度,使刀片高于包埋块,按动标向下黑三角图标的按钮,记录刀头移动的起始位置,灯亮后,向前移动刀架至结束位置,按下向上黑三角图标的按钮,记录结束位置。按RUN/STOP按钮开始震动切片;在这期间,可按PAUSE键立即停止切片,捞取需要的切片暂置于所需缓冲液中 (例如水或者PBS中),再按一次即可启动继续切片;正在切片时,按RUN/STOP按钮,刀片不会立即停止,而是移动到最前端再返回起始位点后才停止切片。(视频6)

    视频6. 自动模式下震动切片

    3.6
    在手动切片模式下,按RUN/STOP按钮开始震动切片,刀头移动到最前端就自动停止,而不会返回到起始位点;在此期间按PAUSE,切片机无响应。

  4. 镜检:将切片转移到载玻片上,同时加一滴水在切片上 (防止片子脱水,破坏组织结构),并盖上盖玻片,在显微镜下镜检拍照。压片时,在样品上滴加透明剂可能会提高镜检效果。
  5. 清理:切片完毕,关闭切片机开关;及时将双面刀片取下;清理样片台上的粘合剂及残留样本;清洗刀架、样品台和冰浴槽等物件;最后做好仪器使用登记。

注意事项

  1. 包埋时,一定要等琼脂糖水溶液冷却到50-60 °C左右时再进行操作(低熔点琼脂糖可以冷却到更低温度),以免温度过高损伤样品。样品数目多或包埋的工作量较大时,可将包埋容器放到50-60 °C的烘片台上进行保温,以延缓琼脂糖的冷却时间。琼脂糖凝固过程中不要反复移动组织,防止切片时发生组织脱落。
  2. 切片时,有两种办法捞取切片:
    一是调节切片机自动连续切片,等切完整个材料后再从水中捞取目的切片到载玻片上。这样做的优点是操作者不易疲劳;缺点是更换下一个样品时要清洗刀头、样品台和缓冲托盘等物件,以防样品污染。
    另一种方法是将切出的每一张切片及时转移到载玻片上,这样可以排除样品污染。如果担心切片落入周围水中不方便捞片(有的切片在水中不易寻找),可以等样品已切好而琼脂块还未切断时,按控制面板上的PAUSE键停止切片。此时切片有一部分与琼脂块相连,用镊子夹取切片转移到载玻片上即可。
  3. 包埋剂的硬度、刀片状态(锋利,表面清洁,没有缺口等)、刀片角度、切片速度、切片厚度和刀头振幅等都会影响到切片的质量。不同组织的切片,对上述参数会有不同要求,需多次试验,以达到最佳效果。如硬度较高的样品最好使用浓度较大的琼脂糖包埋,甚至不用包埋直接切片,同时还可采用较高的刀片移动速度;另外,硬度高的样品(如水稻茎干等),建议进行徒手切片。
  4. 切片时一定注意安全,严防刀片伤到自己。比如,一定要先将样品安装好后再装上刀片开始切片,同时切片完毕先取下刀片再更换样品或清理样品台;刀片一定要在刀架上拧紧,以防切片时刀片飞出伤人。
  5. 震动切片的优点是简单快速,可以做活体切片,利于组织化学或免疫组织化学染色;也有许多缺点,如切片较厚(10-500 μm左右),分辨率较差,切片标本不易长期保存等。一般震动切片的厚度为80-100 μm为最适厚度。
  6. 以上只是常规制样的切片流程,关于切片机构造及相关更详细的操作,请参考切片机说明书。

溶液配方

  1. 透明剂
    常用配方:

    水合氯醛
    8 g
    ddH2O
    3 ml
    丙三醇
    1 ml
    其他配方:

    水合氯醛
    10 g
    ddH2O
    3 ml
    丙三醇
    2 ml
Copyright: © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:王利凯, 李佳佳, 蒋玮, 黄宏林, 郑兰兰, 赵毓. (2018). 震动切片. Bio-101: e1010138. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010138.
How to cite: Wang, L. K., Li, J. J., Jiang, W., Huang, H. L., Zheng, L. L. and Zhao, Y. (2018). Vibrating Section. Bio-101: e1010138. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010138.
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