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蛋白质磷酸化活性分析   

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Original research article

A brief version of this protocol appeared in:
Rice Protocol e-book

实验原理:蛋白质磷酸化指的是由蛋白质激酶催化的把三磷酸腺苷(Adenosine tripHospHate, ATP)或三磷酸鸟苷(Guanosine tripHospHate, GTP)γ位的磷酸基团转移到底物蛋白质氨基酸残基(如丝氨酸、苏氨酸等)上的过程。本实验以放射性同位素标记的[γ-32P]ATP作为磷酸基团的供体,以牛髓磷脂碱性蛋白(myelin basic protein, MBP)作为蛋白质磷酸化的底物(即磷酸基团的受体),与待测蛋白质共同反应,之后通过SDS-PAGE凝胶电泳分离,用放射自显影或磷储屏检测磷酸化蛋白质,从而判断待测蛋白质是否具有磷酸化活性或自磷酸化活性。
实验目的:检测蛋白质是否具有磷酸化活性或自磷酸化活性。

关键词: 磷酸化, 激酶, 同位素, 三磷酸腺苷

材料与试剂

  1. 滤纸
  2. 保鲜膜
  3. 氯化镁 (Magnesium chloride, MgCl2) (Sigma, USA, catalog number: 449172)
  4. 氯化锰 (Manganese(II) chloride, MnCl2) (Sigma, USA, catalog number: 450995)
  5. 牛髓磷脂碱性蛋白 (Myelin Basic Protein bovine, MBP) (Sigma, USA, catalog number: M1891)
  6. 三磷酸腺苷 (Adenosine tripHospHate, ATP) (Sigma, USA, catalog number: A2383)
  7. β-巯基乙醇 (2-Mercaptoethanol) (Fluka, USA, catalog number: 63690)
  8. Tris (ANGUS chemical company, USA, catalog number: 77-86-1)
  9. 二硫苏糖醇 (Dithiothreitol, DTT) (上海生工,中国,catalog number: DB0058)
  10. 考马斯亮蓝R-250(Coomassie Brilliant Blue) (上海生工,中国,catalog number: CB0037)
  11. 十二烷基硫酸钠 (Sodium dodecyl sulfate, SDS) (上海生工,中国,catalog number: SB0485)
  12. 溴酚蓝 (BromopHenol blue) (上海生工,中国,catalog number: B0449)
  13. 甘氨酸 (Glycine) (上海生工,中国,catalog number: G0167)
  14. 盐酸 (Hydrochloric acid, HCl) (国药集团化学试剂有限公司,中国,分析纯)
  15. 甘油 (Glecerol) (国药集团化学试剂有限公司,中国,分析纯)
  16. 异丙醇 (Isopropyl alcohol) (国药集团化学试剂有限公司,中国,分析纯)
  17. 冰醋酸 (Acetic acid) (国药集团化学试剂有限公司,中国,分析纯)
  18. 95%乙醇(Ethanol) (国药集团化学试剂有限公司,中国,分析纯)
  19. Kinase Buffer (见溶液配方)
  20. 5x SDS-PAGE Loading Buffer (见溶液配方)
  21. 5x Tris-Glycine Buffer (见溶液配方)
  22. 考马斯亮蓝R-250染色液 (见溶液配方)
  23. 脱色液(见溶液配方)

仪器设备

  1. Mini-PROTEAN® Tetra System (Bio-Rad, USA)
  2. 盖革计数器
  3. 移液枪
  4. 暗夹

实验步骤

  1. 预先在冰上配制kinase buffer (溶液配方1);
  2. 加入1-5 μg待测蛋白和1-5 μg MBP (检测待测蛋白是否具有自磷酸化活性时,不添加MBP) 至上述缓冲液中,使终体积为20 μl;
  3. 室温 (或置26 °C水浴中) 反应30 min;
  4. 加入5 μl 5x SDS-PAGE loading buffer (溶液配方2),75 °C加热5-10 min;
  5. 冷却至室温;
  6. 12% SDS-PAGE凝胶电泳分离,待染料线距离凝胶底部1-2 cm时停止电泳;
  7. 用塑料铲板将浓缩胶及染料线之下的凝胶 (包含染料线) 切下丢弃,剩余凝胶置于蒸馏水中漂洗掉表面的SDS,然后将凝胶置于滤纸上吸干水分,用保鲜膜将凝胶包好;
  8. 在暗室中进行下列操作:将已经用保鲜膜包好的凝胶置于暗夹中,用X-光片覆盖于凝胶上,扣好暗夹并将暗夹置于避光处 (如抽屉中) 3-5 h;
  9. 在暗室中将X-光片显影并定影,之后用考马斯亮蓝R-250染色液对凝胶染色并用脱色液脱色;
  10. 扫描或拍照X-光片及脱色后的凝胶,对结果进行分析。

注意事项

  1. 对于某些对特殊离子具有依赖性的蛋白激酶 (如钙离子依赖性蛋白激酶),应对kinase buffer中的成分进行调整。
  2. 对于某些对温度敏感的蛋白激酶,应调整步骤3中的反应温度。
  3. 步骤4中避免加热温度过高或时间过长,否则离心管盖容易冲开,造成管内液体飞溅,从而造成同位素污染事故。
  4. 放射性同位素操作应在规范的专用操作室内进行;含放射性同位素的废弃物 (废纸、废液等) 应按规定进行规范处理。
  5. 尽量避免待测蛋白在制备过程中活性受到损害。

溶液配方

  1. Kinase Buffer
    50 mM Tris-HCl, pH 7.5
    10 mM MgCl2
    10 mM MnCl2
    1 mM DTT
    0.2 mM ATP
    5 μCi [γ-32P]ATP
    该缓冲液于冰上配制,现配现用,不可长久保存。
  2. 5x SDS-PAGE Loading Buffer
    250 mM Tris-HCl, pH 6.8
    10% (w/v) SDS
    0.5% (w/v) BromopHenol Blue
    50% (v/v) Glycerol
    用前加入5% (v/v) β-巯基乙醇或50 mM DTT,加入β-巯基乙醇或DTT的loading buffer可在室温下放置一个月。
  3. 5x Tris-Glycine Buffer
    0.125 M Tris
    1.25 M Glysine
    0.5% (w/v) SDS
  4. 考马斯亮蓝R-250染色液
    0.1% (w/v) 考马斯亮蓝R-250
    25% (v/v) 异丙醇
    10% (v/v) 冰醋酸
  5. 脱色液
    10% (v/v) 冰醋酸
    5% (v/v) 乙醇
Copyright: © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:马海港, 唐宁, 袁猛. (2018). 蛋白质磷酸化活性分析. Bio-101: e1010129. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010129.
How to cite: Ma, H. G., Tang, N. and Yuan, M. (2018). Protein Phosphorylation Activity Assay. Bio-101: e1010129. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010129.
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