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水稻叶片叶绿体蛋白分离及检测   

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实验原理:水稻叶绿体是水稻光合作用和多种激素合成的场所,很多核编码蛋白及叶绿体编码蛋白在叶绿体中发挥重要功能。水稻叶绿体蛋白的分离需先用机械研磨叶片,进行percoll密度梯度离心,以分离出完整未破损叶绿体,再用细胞裂解液将叶绿体裂解,分离出叶绿体蛋白。
实验目的:分离叶绿体蛋白,研究蛋白的定位、功能及质核信号的传导。

关键词: 水稻, 叶绿体蛋白, 分离检测

材料与试剂

  1. 75目细胞筛
  2. 50 ml圆底离心管
  3. 各种型号枪头
  4. 水稻叶片
  5. 液氮
  6. Sorbitol (Biotech, catalog number: S0691)
  7. Tricine (Sigma, catalog number: T0377)
  8. DTT (Sigma, catalog number: 43815)
  9. EDTA (Sigma, catalog number: E6758)
  10. MgCl2 (Sigma, catalog number: M9272)
  11. BSA (Roche, catalog number: BP0045)
  12. Lysis buffer (pH 7.85)
  13. Tricine
  14. Glycerol (国药,catalog number: 1001618)
  15. PMSF (Sigma, catalog number: P7626)
  16. Percoll (GE, catalog number: 17-0891-09)
  17. Cysis buffer
  18. 5x Sample buffer
  19. 2.5x CIB (chloroplasts isolation buffer), pH 7.85 (见溶液配方)
  20. Lysis buffer, pH 7.85 (Completely Soluble Mixture of Chloroplast Components) (见溶液配方)
  21. 40% percoll (见溶液配方)

仪器设备

  1. 研钵
  2. 天平
  3. 高速离心机
  4. 量筒
  5. 水浴锅
  6. 电泳仪
  7. 移液枪
  8. Western blot装置 (Mini-PROTEAN from Bio-Rad, catalog number: 164-8003)

实验步骤

  1. 清晨时液氮取样约3 g,磨样不要磨太碎,加1x CIB 15 ml。
  2. 轻摇几次后立即用75目筛子过滤至新的50 ml管子。
  3. 4 °C 200 x g洗涤离心3 min,下面会出现白色沉淀 (淀粉等杂质),把上清绿色部分移至一新50 ml离心管内,1,000 x g洗涤离心7 min,收集沉淀部分 (分离叶绿体在绿色沉淀部分,弃上清,因上清中是少量破碎叶绿体)。
  4. 用1 ml 1x CIB轻轻地把叶绿体打散 (最好用手指轻弹),移至一新的2 ml管内。
  5. 在2 ml管内配制1.5 ml 40% percoll (每个样分至2个管内)。把步骤4的叶绿体悬浮液轻轻摇散,加至2 ml管内在上部,此时勿摇动。
  6. 4 °C 1,700 x g离心6 min后破碎叶绿体形成一条带在percoll的上层,完整的叶绿体在40% percoll的底部。
  7. 轻轻移出上层percoll液体,用1x CIB (without BSA) 1-2 ml重悬叶绿体后4 °C 1,700 x g 离心3 min (洗去percoll) 后弃上清,用两倍沉淀体积Cysis buffer,打散后冰上30 min,利用离子渗透压的不同使叶绿体裂解开来,加5x Sample buffer,(每5 μl溶解液中加1 μl蛋白Sample buffer)。
  8. 100 °C,高温裂解5 min。12,000 rpm离心10 min后取上清点样。
  9. 制12% PAGE胶,点样每孔10 μl,70 V电泳20 min,110 V电泳约1.5 h后转膜做Western blot,操作方法见Western blot (宗伟等,2018)。

注意事项

  1. 清晨取样,淀粉含量较少,方便叶绿体分离。
  2. 所有步骤应在冰盒上,且弱光进行。
  3. 在转移叶绿体时,移液器枪头应剪宽使用。

溶液配方

  1. 2.5x CIB (chloroplasts isolation buffer), pH 7.85 (200 ml)
    1.25 M Sorbitol (Biotech)
    45.4 g
    125 mM Tricine (Sigma)
    4.48 g
    2.5 mM DTT (Sigma)
    0.077 g
    2.5 mM EDTA (Sigma)
    0.146 g
    2.5 mM MgCl2 (Sigma)
    5 ml (100 mM)
    2.5%(w/v) BSA (Roche)

    使用时稀释至1x CIB。BSA使用终浓度为0.1%,可配成10% BSA母液,使用时再稀释。(-20 °C存放)
  2. Lysis buffer , pH 7.85 (Completely Soluble Mixture of Chloroplast Components) (100 ml)
    10 mM Tricine
    0.179 g
    2 mM EDTA
    0.0584 g
    2 mM DTT
    100 μl (0.5 M DTT) (用前添加)
    10% (v/v) glycerol
    10 ml (100% glycerol) (国药)
    0.0025% PMSF (Sigma)
    用前添加
  3. 40% percoll (GE) (100 ml)
    40 ml percoll
    20 ml ddH2O
    40 ml 2.5x CIB

参考文献

  1. 宗伟,程赛凤,马斯琦,熊立仲. (2018). Western Blot. Bio-101 e1010130. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010130.
Copyright: © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:都浩, 马斯琦, 熊立仲. (2018). 水稻叶片叶绿体蛋白分离及检测. Bio-101: e1010123. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010123.
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