Nuclear Protein Isolation Protocol   

材料与试剂

注：所有试剂尽量用sigma进口试剂。

1. 液氮
   
2. 10 ml/50 ml离心管
   
3. 1.5 ml离心管
   
4. Miracloth (Calbiochem, catalog number: 475855)
   
5. 各种型号枪头
   
6. HEPES (pH 7.8)
   
7. KCl
   
8. MgCl₂
   
9. EDTA
   
10. Sucrose
    
11. Triton X-100
    
12. DTT
    
13. PMSF
    
14. Glycerol
    
15. Buffer A (见溶液配方)
    
16. Low Salt Buffer (见溶液配方)
    
17. High Salt Buffer (见溶液配方)
    
18. Dialysis Buffer (透析液) (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 量筒
   
2. 烧杯
   
3. 天平
   
4. 高速离心机
   
5. 移液枪
   
6. 振荡器
   
7. 摇床
   
8. 磁力转子
   
9. 磁力搅拌器
   
10. 计时器
    
11. 透析袋
    

实验步骤

1. 液氮磨样。
   
2. 称5-10 g粉末，装入预冷10 ml/50 ml tube中，加入15-30 ml Buffer A，摇匀，致混合物呈可流动的粘稠液体。置冰上10 min，间或颠倒。
   
3. 膜布(Miracloth)过滤，先单层膜布滤一次，再双层膜布滤一次。
   
4. 将所得上清液4 °C离心，3,000 x g，20 min，可见绿色沉淀。
   
5. 弃上清，用5 ml Buffer A重悬沉淀，轻柔吸打混匀，转至10 ml tube中。
   
6. 4 °C离心，2,000 x g，15 min。
   
7. 弃上清，用1 ml Buffer A重悬沉淀，轻柔吸打混匀，转至1.5 ml tube中。
   
8. 4 °C离心，2,000 x g，10 min。
   
9. 弃上清，加180 μl Low Salt Buffer，吸打混匀 (较难吸打)。
   
10. 加270 μl High Salt Buffer，吸打混匀；若起始样品量较多，此步样品将变得极粘稠，吸打不动，只能用枪头搅匀。
    
11. 将样品用冰袋包裹，放振荡器上振30 min；或置翻转摇床上4 °C摇1 h。
    
12. 4 °C离心，14,000 x g，20 min。
    
13. 吸上清，会吸到很多混浊物，再14,000 x g，4 °C离心5 min。
    
14. 吸上清，移入1.5 ml tube中，-20 °C/-70 °C保存。如需进一步纯化见下步。
    
15. (可选)透析：将上清吸入透析袋中，用夹子夹好，放入装有500 ml透析液的烧杯中，烧杯中加磁力转子，放在冰盒中，置磁力搅拌器上，透析袋漂浮于液面上，2 h；
    
16. (可选)透析好的蛋白，从透析袋中吸出，移入1.5 ml tube中，-20 °C/-70 °C保存。
    

注意事项

1. 所有操作均须在冰上进行，各种离心管、Buffer用前也需置冰中预冷。
   
2. 根据样品量的多少，可相应适量增减几种Buffer用量。
   

溶液配方

注：所有试剂尽量用sigma进口试剂。

1. Buffer A
   10 mM HEPES(pH 7.8)
   10 mM KCl
   10 mM MgCl₂
   5 mM EDTA
   250 mM sucrose
   0.5% Triton-X-100
   用前添加：1 mM DTT；0.2 mM PMSF
   冰上预冷
   
2. Low Salt Buffer
   20 mM HEPES (pH 7.8)
   20 mM KCl
   1.5 mM MgCl₂
   0.2 mM EDTA
   25% Glycerol
   用前添加：0.5 mM DTT；0.2 mM PMSF
   冰上预冷
   
3. High Salt Buffer
   20 mM HEPES (pH 7.8)
   1.6 M KCl
   1.5 mM MgCl₂
   0.2 mM EDTA
   25% Glycerol
   用前添加：0.5 mM DTT；0.2 mM PMSF
   冰上预冷
   
4. Dialysis Buffer(透析液)
   20 mM HEPES(pH 7.8)
   100 mM KCl
   0.2 mM EDTA
   20% Glycerol
   用前添加：0.5 mM DTT；0.2 mM PMSF
   冰上预冷