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水稻组蛋白抽提   

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实验原理:组蛋白是一类碱性蛋白,且分子量很小,这里介绍的组蛋白抽提方法不能得到非常纯的组蛋白,只是相对富集分子量较小的碱性蛋白,但是基本能满足一般的实验要求。

关键词: 组蛋白, 三氯乙酸, 水稻

材料与试剂

  1. 1.5 ml进口离心管
  2. 50 ml 离心管
  3. 各种型号枪头 (20 μl, 200 μl, 1 ml)
  4. Miracloth (Calbiochem, catalog number: 475855)
  5. Protease Inhibitor (Roche, catalog number: 11836153001)
  6. 水稻样品
  7. 液氮
  8. 三氯乙酸 (国药集团)
  9. 丙酮 (国药集团)
  10. EDTA
  11. HCl
  12. DTT (Sigma, catalog number: D0632)
  13. 组蛋白抽提缓冲液 (见溶液配方)
  14. 100%三氯乙酸 (见溶液配方)

仪器设备

  1. 移液枪
  2. 量筒
  3. 超净工作台
  4. 通风橱
  5. 天平
  6. 干浴锅
  7. 高速冷冻离心机

实验步骤

  1. 取50 ml离心管,加入20 ml预冷的组蛋白抽提缓冲液,置于冰上待用。
  2. 液氮研磨样品,取2 g粉末加入到抽提缓冲液中,充分混匀,用单层的Miracloth (Calbiochem)过滤掉残渣 (视频1)。

    视频1. 样品匀浆后单层Miracloth过滤

  3. 4度冷冻离心,12,000 x g离心10分钟。
  4. 取16 ml上清于另一离心管中,加入4 ml的100%三氯乙酸 (视频2)。

    视频2. 样品上清转移及三氯乙酸沉淀蛋白

  5. 混匀后17,000 x g冷冻离心30分钟 (转速较高,注意选择进口的离心管)。
  6. 弃上清,用1 ml左右-20 °C预冷的丙酮洗涤沉淀 (管壁上也有一层乳白色的沉淀,注意一并洗下,避免丢失) 并转移到1.5 ml进口离心管中 (视频3)。

    视频3. 丙酮沉淀蛋白

  7. 12,000 rpm冷冻离心10分钟,弃上清。
  8. 重复步骤6、7两次,每次洗涤时要注意把沉淀彻底打碎,重悬沉淀。
  9. 弃上清,置于超净台吹干或通风橱中让丙酮挥发至沉淀如粉状。
  10. 加入适量1x Laemmli buffer (一般2 g样品对应200-300 μl),室温溶解过夜 (视频4)。

    视频4. 蛋白溶解

  11. 溶解后的样品置于95度以上干浴中10分钟,离心取5 μl左右样品15% SDS-PAGE检测,会发现有很多蛋白条带,位于14-17KD的位置有几条比较明显的条带,组蛋白即包含其中 (见图1)。


    图1. 组蛋白SDS-PAGE电泳胶图

注意事项

  1. 通常用于沉淀蛋白的三氯乙酸终浓度是10%-20%,尤其适用小分子量的蛋白。
  2. 三氯乙酸固体极易吸水潮湿,注意干燥保存。
  3. 丙酮具有较强的腐蚀性和挥发性,因此操作时需要在通风橱中进行,并避免沾到手上。

溶液配方

  1. 组蛋白抽提缓冲液

  2. 100%三氯乙酸
    称取100 g三氯乙酸固体(TCA),加水溶解至100 ml
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Copyright: © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:陈香嵩, 周少立, 宗伟, 赵毓. (2018). 水稻组蛋白抽提. Bio-101: e1010121. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010121.
How to cite: Chen, X. S., Zhou, S. L., Zong, W. and Zhao, Y. (2018). Histone Extraction from Rice. Bio-101: e1010121. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010121.
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旭 陈
您好,请问lamini buffer配方有吗?另外可以用NP40配的蛋白裂解液溶解吗?、
12/25/2020 8:05:23 PM Reply
毓 赵

4 X Lamini buffer 配方: 200mM Tris-HCl(pH6.8) 8% SDS 0.4% 溴酚蓝 40% 甘油 4%巯基乙醇 . NP-40属于非离子性温和去垢剂,对于核蛋白抽提的裂解效果不是很好,我们蛋白裂解液选择去垢剂的标准是: 细胞质蛋白:1% Triton X-100(一种足够), 细胞核蛋白: 1% Triton X-100 +0.1%SDS+0.5% Sodium deoxycholate(三种混合使用)

12/29/2020 11:42:33 PM Reply


zhimei zhu
中国海洋大学
想咨询蛋白定量在哪一步进行
10/29/2020 7:21:57 AM Reply
毓 赵

溶解以后

10/29/2020 8:41:46 PM Reply


zhimei zhu
中国海洋大学

感谢您的回答,还想请教两个问题加入 Laemmli buffer溶解里面有溴酚蓝,会影响蛋白定量麽,另一个是 Laemmli buffer可以用SDS蛋白上样缓冲液代替么

5/25/2021 11:37:21 PM Reply


kezhi zheng
南京农业大学
您好: 我想问一下,为什么丙酮洗涤完再溶解发现组蛋白不溶解是什么原因?
10/28/2020 11:06:01 PM Reply
zhimei zhu
中国海洋大学

我也有遇到过

10/29/2020 7:23:06 AM Reply


毓 赵

抽提组蛋白过程用的是三氯乙酸酸性抽提法(组蛋白是碱性蛋白,通过这种酸性试剂进行富集),但三氯乙酸属于强酸,裂解时除了组蛋白外很多细胞内物质同时被裂解释放,最终抽提完成后的出现的大部分白色部分,大概为:其他的细胞物质的碎片,组蛋白在白色沉淀中只占很小一部分,因为组蛋白分子量比较小,后续可以用lamini buffer 85℃ 孵育可以辅助溶解,而分子量较大或者更为复杂的其他物质在无充足SDS条件下,强酸变性聚集成块,很难溶解,如同鸡蛋清煮熟成块一样。可以利用加入lamini Buffer 85℃延长孵育时间增加组蛋白溶解(丙酮洗涤作用只是除去叶绿素等色素的作用,让抽提纯度会提高一点)

10/29/2020 8:41:00 PM Reply


kezhi zheng
南京农业大学

那你是怎么解决的?

10/30/2020 4:41:27 PM Reply


zhimei zhu
中国海洋大学

不溶解的可能不是组蛋白而是其它的杂质

5/24/2021 10:42:57 PM Reply


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