实验原理:组蛋白是一类碱性蛋白,且分子量很小,这里介绍的组蛋白抽提方法不能得到非常纯的组蛋白,只是相对富集分子量较小的碱性蛋白,但是基本能满足一般的实验要求。
关键词: 组蛋白, 三氯乙酸, 水稻
材料与试剂
仪器设备
实验步骤
注意事项
溶液配方
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4 X Lamini buffer 配方: 200mM Tris-HCl(pH6.8) 8% SDS 0.4% 溴酚蓝 40% 甘油 4%巯基乙醇 . NP-40属于非离子性温和去垢剂,对于核蛋白抽提的裂解效果不是很好,我们蛋白裂解液选择去垢剂的标准是: 细胞质蛋白:1% Triton X-100(一种足够), 细胞核蛋白: 1% Triton X-100 +0.1%SDS+0.5% Sodium deoxycholate(三种混合使用)
溶解以后
感谢您的回答,还想请教两个问题加入 Laemmli buffer溶解里面有溴酚蓝,会影响蛋白定量麽,另一个是 Laemmli buffer可以用SDS蛋白上样缓冲液代替么
我也有遇到过
抽提组蛋白过程用的是三氯乙酸酸性抽提法(组蛋白是碱性蛋白,通过这种酸性试剂进行富集),但三氯乙酸属于强酸,裂解时除了组蛋白外很多细胞内物质同时被裂解释放,最终抽提完成后的出现的大部分白色部分,大概为:其他的细胞物质的碎片,组蛋白在白色沉淀中只占很小一部分,因为组蛋白分子量比较小,后续可以用lamini buffer 85℃ 孵育可以辅助溶解,而分子量较大或者更为复杂的其他物质在无充足SDS条件下,强酸变性聚集成块,很难溶解,如同鸡蛋清煮熟成块一样。可以利用加入lamini Buffer 85℃延长孵育时间增加组蛋白溶解(丙酮洗涤作用只是除去叶绿素等色素的作用,让抽提纯度会提高一点)
那你是怎么解决的?
不溶解的可能不是组蛋白而是其它的杂质