研究背景

在矿山生态修复过程中，植物面临金属胁迫和寡营养等挑战，导致生态修复效果不佳。而先锋植物微生物组通过固氮、溶磷和分泌铁载体等机制，促进植物生长和营养吸收，并通过螯合或转化金属，降低重金属毒性，增强植物耐受性[1]。因此，根际微生物接种已成为促进植物修复的重要方法[2]。尽管商业菌株的应用已相当普遍，但其在根际中的定植和功能发挥受到环境显著影响[3]，且由于缺乏对多样宿主的适应性，商业菌株的功效往往不够可靠，导致预期效果不佳[4]。而根系土著微生物更能适应当地环境，具有更好的定植效果和功能表现[5]。因此，快速筛选适宜分选的根际样品，并原位分离具有促生潜力的微生物至关重要。目前，常用传统平板划线分离方法分离目标功能菌株，但这种方法繁琐且周期长，分离效果差[6]。相比之下，通过极限稀释结合96孔培养板的分离能够显著提高分离效率，可以在短时间内获得大量纯种菌株，并结合基因测序，可快速获取微生物的遗传信息及代谢功能。考虑到单一微生物的功能有限难以适应复杂的环境，由单菌合成得到的低复杂性和高可控性的SynCom的研究也越来越受到关注[7]。例如，土著SynCom可通过多种植物促生机制有效提高植物的生产力和抵御胁迫的能力[8,9]。这些SynCom还能与原生土壤中的植物宿主共同进化，尤其是在矿区等营养有限的环境条件下，土著SynCom对土壤功能和植物发育具有持久的积极影响[10]。因此，如何选择功能互补且稳定的菌群成员并构建有效的SynCom成为当前研究的重点。基于此，本研究提出了一种用于识别、分离、高效合成矿区先锋植物根际促生菌群的方法。

主要流程
首先快速判断和筛选出具有分选潜力的先锋植物根际样品。随后，采用极限稀释结合96孔培养板的方法对这些样品中的根际微生物进行高效分离，并通过基因测序获取其遗传信息和代谢功能。最后，基于所筛选出的功能菌株，构建低复杂性且高可控性的合成菌群，并通过植物促生实验验证其在矿区生态修复中的潜力（图1)。


图 1. 本文工作流程示意图

材料与试剂

1. 移液器枪头
2. EP管
3. 50 mL离心管
4. 96孔细胞培养板（比克曼）
5. Parafilm封口膜 （比克曼）
6. 0.22 μm 无菌过滤膜（比克曼）
7. PCR板 （比克曼）
8. 营养土壤
9. 珍珠岩
10. 蛭石
11. 营养钵
12. 次氯酸钠（上海国药，分析纯）
13. 氯化镁（上海国药，分析纯）
14. 酒石酸锑钾（上海国药，分析纯）
15. 70%乙醇溶液
16. 琼脂粉（上海国药，分析纯）
17. 无菌去离子水
18. 磷酸缓冲液 （biosharp）
19. FeCl₃（上海国药，分析纯）
20. 浓H₂SO₄（上海国药，分析纯）
21. 吲哚乙酸（上海国药，分析纯）
22. 拟南芥（野生型 col-0）
23. 甘油（上海国药，分析纯）
24. 液氮
25. 大肠杆菌DH5α（Thermo Scientific）
26. Loading Buffer（Biosharp BL532A）
27. 碱裂解Buffer I（25 mM NaOH and 0.2 mM Na2—EDTA，pH = 12）（Biosharp BL532A）
28. 中和缓冲液Buffer II（40 mM Tris-HCI，pH=7）（Biosharp BL532A）
29. 2.5%有效氯浓度的次氯酸钠溶液（见溶液配方）
30. 1/2 MS 固体培养基（见溶液配方）（比克曼）
31. 1/10 TSB 液体培养基（见溶液配方）（青岛海博）
32. LB 液体培养基（见溶液配方）
33. 无机磷培养基（见溶液配方）（青岛海博）
34. Ashby无氮培养基（见溶液配方）（青岛海博）
35. CAS培养基（见溶液配方）（青岛海博）
36. R2A固体培养基（见溶液配方）（青岛海博）
37. SV Gel and PCR Clean-up System试剂盒
38. Quant-iTTM PicoGreenTM dsDNA Assay Kit分析试剂盒
39. DNeasy Powersole试剂盒（Qiagen，Dresden，德国）
    

仪器设备

1. 生物安全柜/超净工作台（Thermo Fisher, 1300 Series A2）
2. 高压蒸汽灭菌锅（力辰，DGL-35G）
3. 可见分光光度计（北京普析，T400F）
4. 电子天平（力辰，LC-FA2004）
5. 高速离心机（Eppendorf, 5810r）
6. 八通道移液器（Thermo, Scientific）
7. 三角锥型瓶（蜀牛）
8. 微孔板离心机（迈克尔，MK-30）
9. 恒温培养摇床（一恒，THZ）
10. 超低温冰箱（Thermo, 906-Ults）
11. PCR仪（Bio-Rad, CFX96）
12. 凝胶电泳仪（伯兰特，DYCP-31DN）
    

实验步骤