研究背景

近年来，随着对复杂微生物群落结构和功能研究的不断深入，构建并应用合成菌群（SynComs [1]）已经逐渐成为开展农业 [2]、医药 [3]、生态 [4]、环境 [5]、能源 [6]等领域相关微生物组功能和微生物生态学研究的基本需求。未来，采用“自下而上”的方法开展设计合成菌群的研究，将会扩展到包含数十甚至数百种菌株的复杂菌群 [7]。理论上，合成菌群的配伍组合数量随着菌群数量的增加呈指数级增长（包含N个菌株的合成菌群体系中不同组合的数量为2^N个），例如包含10株菌株的合成菌群体的组合数为1,024个。受限于此，既往研究通常未能覆盖所有可能的组合数，而是仅涉及其中少数合成菌群组合，这可能会影响我们对菌群涌现性功能和产生机制的理解。为了满足特定的研究需要，有时有必要穷尽式的构建所有可能的合成菌群组合。
目前，构建大量合成菌群的工作主要采用人工、自动化设备、微液滴技术等方法完成。其中自动化设备，比如apricot DC1移液工作站，虽然一定程度上实现了高重复性和高精确度，但是牺牲了一些机动性，并且仪器以及耗材的成本非一般实验室可以承担。另外，虽然微液滴技术在高通量筛选合成菌群的研究中显示出巨大的潜力，但是当前其应用受到诸多技术障碍的限制 [8]。按照传统的构建思路，人工无疑是效率最低且失误率最大的方法，然而，本方法通过对加样顺序的合理规划能够显著提高人工构建合成菌群的效率，同时显著降低失误率，为相关领域研究者们提供一种方便实用的实验策略。

原理与方法

合成菌群是人工构建的简单微生物群落，通常含有的物种数目在3–7个之间。为了能够穷尽式构建n个物种所有可能的物种组合，需要考虑包含0个物种、1个物种、双物种、多物种，以及n个物种的情况。以n=10为例，根据排列公式可知全部的物种组合数目N可以通过以下公式计算得到（公式1）：



如图1所示，这个穷尽式构建方案中，不含任何物种（无菌）的组合数目为1个，单一物种组合数为10个，双物种组合数为45个，三物种组合数为120个等。全部的组合数为1024个。无菌、单菌等组合虽然不能称为传统意义上的菌群，但是对于研究来说是必不可少的对照，因此也属于这一合成菌群体系的重要成员。


图1. 以10个菌株为例，穷尽式构建合成菌群时含有不同物种数目的合成菌群的组合数目。

推广开来，若设n个菌株构建得到的全部可能合成菌群组合数目为N，则由二项式定律，可推得该数目的值等于2的n次方（公式2）。因此，合成菌群的组合数目会随着菌株数目的增加指数增加。鉴于此，如果采用人工操作的方法，在短时间内构建数十个不同的合成菌群可能比较容易，但是随着物种数目增加，当需要处理上百种不同的组合时，如果没有合理的设计，那么将非常容易出现错误。



从组合数学的角度来看，2ⁿ 代表了从n个元素中选取子集的所有可能方式的总数。每个子集对应一个0–1向量，其中0表示不包含某元素，1表示包含某元素。因此，当我们对这些向量进行排序后，它们可以有序的排列在2^n-1 × 2^n-1 布局的二维平面上。这就为我们合理规划构建合成菌群过程中的加样顺序提供了重要指引。
由于实验室中并没有2^n-1 × 2^n-1的微孔板，而常见的微孔板只有24孔、96孔和384孔等规格，所以实验操作以行和列为单位在24孔板、96孔板、384孔板提供的加样空间上有序开展。每个合成菌群的组合都依据所处的孔板和在孔板中的位置给出唯一编码。最终，该方法能够实现在短时间内构建超过一千个不同的合成菌群组合。在后两种微孔板上构建合成菌群的时候，通过使用多通道移液器进行操作，可以大幅提高工作效率。为了能够明确加样完成后每个孔位中所包含合成菌群的菌株组成，我们还开发了一个R语言软件包syncons。该软件包可以运行在本地或者通过云服务来访问，除了提供合成菌群编码信息，还有加样流程查询和数据采集表格初始化等功能。
总的来说，本方法旨在利用实验室常见的材料与仪器，通过对加样顺序的合理规划提高了人工构建合成菌群的效率，同时还可以减少失误、避免交叉污染，为相关领域研究者们提供一种方便实用的实验策略。

材料与试剂

1. 菌株
   不同菌株以代号区分，本文中分别表示为菌株S1、菌株S2、菌株S3、菌株S4、菌株S5、菌株S6、菌株S7、菌株S8、菌株S9、菌株S10、菌株S11，一共有11个不同的细菌菌株。
2. 24孔板 (Corning, catalog number: 3524)
3. 96孔板 (Corning, catalog number: 3599)
4. 384孔板 (Axygen^®, catalog number: P-384-240SQ-C-S)
5. 移液器吸头 (Biosharp, catalog number: BS-200-T)
6. 加样槽 (Biosharp, catalog number: BS-PS50-RR)
7. 培养基 (BD, catalog number: GD-211825)
   

仪器设备

1. 摇床 (华美生化仪器, catalog number: THZ-701B)
2. 单通道移液器 (Thermo Scientific^TM, catalog number: 4651140N)
3. 8通道移液器 (Thermo Scientific^TM, catalog number: 4661010N)
4. 16通道移液器 (EVOLVE, catalog number: 3044)
5. 超净工作台 (苏净安泰AIRTECH, catalog number: ES-A01-VS-1300L-U)
   

实验步骤