Methods for Collection and Analysis of Gut Microbiota in Soil Animals

研究背景

土壤动物种类众多、数量庞大，具有多样的生态型和取食策略。作为土壤生物多样性的重要组成部分，土壤动物在生态系统物质循环、土壤健康评价方面发挥着重要作用 (邵元虎 等, 2015; 孙新 等, 2021)。土壤动物肠道系统定居着细菌、真菌在内丰富多样的微生物 (Hao et al., 2020; Wang et al., 2021)，这些微生物对土壤动物本身食物消化、营养获取、发育和健康均发挥着至关重要的作用 (Bahrndorff et al., 2018; Zhu et al., 2018)。同时，土壤动物肠道微生物能够直接或间接地调控土壤生态学效应，并影响土壤健康 (Ding et al., 2019; Sun et al., 2020)。肠道微生物是联系土壤动物宿主和外界环境的重要纽带，受宿主和环境因素共同影响。随着高通量测序手段及组学技术的发展，快速和定量研究土壤动物肠道微生物多样性已成为土壤生态学和微生物生态学领域研究热点 (Kudo et al., 2019; Zhu et al., 2021; Gong et al., 2022)。
近些年，土壤动物肠道微生物领域研究年发文量增长快速 (郝操 等, 2022)。目前，土壤动物肠道微生物多样性和群落组成及其驱动机制，群落内物种共存机制和群落构建的理论研究是土壤动物肠道微生物多样性领域研究的前沿 (Berg et al., 2016; Gong et al., 2018; Kudo et al., 2019; Zhu et al., 2021)。土壤动物肠道微生物介导的环境安全如抗性基因、微塑料、人类实践 (土地利用方式和农业施肥管理) 以及两者之间的联系是土壤动物肠道微生物领域的热点研究内容 (Zhu et al., 2018; Ding et al., 2019; Zhang et al., 2021; Song et al., 2022)。土壤动物肠道微生物的提取和分析是土壤动物肠道微生物研究的基础 (郝操 等, 2022)。科学的土壤动物取样和保存方法，可靠的肠道微生物采集方法及准确的微生物多样性分析程序，对于更好地开展土壤动物肠道微生物多样性研究意义重大。但迄今为止，还没有规范的关于土壤动物肠道微生物多样性研究方法的文献和资料的发表。因此，本文从土壤动物样品的收集和保存及其肠道微生物采集、DNA提取和高通量测序程序几个方面进行详细阐述，以期为土壤动物肠道微生物多样性研究提供方法性见解，有利于土壤动物肠道微生物研究的标准化和规范化。

实验流程图

材料与试剂

1. 无菌移液枪头 (10 µL，200 µL，1,000 µL) 
2. 无菌EP离心管 (1.5 mL和2 mL)
3. 无菌手套
4. 无菌剪刀
5. 无菌镊子
6. 无菌药勺
7. 无菌昆虫针
8. 无水乙醇
9. ddH₂O
10. Fast DNA^® Spin Kit for Soil试剂盒 (MP Biomedicals, American)
11. PCR用8联管
12. 上/下游引物
    细菌通用引物集：
    515F (5'-GTGCCAGCMGCCGCGG-3')
    806R (5'-GGACTACNVGGGTWTCTAA-3')
    真菌通用引物集：
    ITS1F (5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3')
    ITS2 (5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3')
13. 2× Taq PCR预混液 (Diamond)
14. 琼脂糖
15. TAE缓冲液 (50×；pH 8.0-8.6)
16. 4S Green Plus无毒核酸染料 (BBI)
17. DNA Marker (100-2,000 bp, Sangon Biotech)
18. AxyPrep DNA Gel Extraction Kit试剂盒 (Axygen Biosciences, American)
19. Tris-HCl缓冲液 (1 mol/L；pH 7.4-7.6)
    

仪器设备

1. 超净工作台
2. 体视镜
3. 显微镜
4. 涡旋仪
5. 研磨仪 (Fast Prep-24, MP Biomedicals, American)
6. 高速离心机 (Thermo Scientific)
7. Eppendorf移液枪 (10 µL, 100 µL, 200 µL, 1,000 µL)
8. 恒温水浴锅 (0~100℃)
9. NanoDrop 2000超微量分光光度计
10. PCR仪 (ABI GeneAmp^® 9700)
11. 制胶槽
12. 凝胶成像系统
13. 荧光投射切胶仪
14. Illumina Miseq PE300测序平台
    

实验步骤