研究背景

真菌无处不在，种类繁多，据估计全世界有真菌150万种，已报道的有10万余种。许多真菌是野生和栽培植物的病原菌，能引起植物病害，真菌病害是植物病害中最大的一类，约占全部植物病害的70%- 80%。几乎每种作物上都有一到几种真菌病害，多的有十几种 (DEAN et al., 2012)，白粉病是目前世界公认植物十大真菌病害之一，因产生大量覆盖于宿主表面的白色或无色的分生孢子而得名(Glawe, 2008)。白粉菌能够侵染多种植物的地上部分，包括多种农作物和经济作物的叶、茎、花和果实，严重影响植物的生长发育和结实 (Braun et al., 2002)。虽然有关于植物上感染常见的白粉病菌已有详细研究，但很多白粉菌种类及其宿主尚不清楚。同时，由于不同植物上的白粉病病原菌分类不同，且白粉病菌寄主范围十分广泛且可能扩大，仍有大量植物白粉病病原菌信息仍不明确。当前对于白粉菌分类等基础学科研究相对匮乏，严重影响白粉菌的深入研究。
早期阶段有关于白粉菌的分类大多依据其形态学的特征。随着测序技术的发展，现阶段白粉菌的分类研究不仅依据其形态学特征，同时通过对其保守序列的测序及其生物进化发育关系，更准确的鉴定白粉菌种类 (Braun, 2012)。快速准确的鉴定白粉病菌种类是进行植物保护的必要手段。本文通过图、文及视频介绍有关白粉病菌的鉴定，以期提供实验简单且快速高效的操作方法，准确鉴定白粉菌种类，同时为后续针对性的开展白粉菌的鉴定及综合防治奠定理论依据和基础 (视频1, 2)。

材料与试剂

1. 植物叶片
2. 离心管（Biosharp，catalog number: BS-15-MA）
3. 枪头（Biosharp，catalog number: BS-10-T）
4. SDS（Solarbio，catalog number: S1010）
5. NaCl（天津市德恩化学试剂有限公司）
6. Tris-HCl（Solarbio，catalog number:T8230）
7. EDTA (Invitrogen，catalog number: AM9262）
8. DEPC water（Thermo Fisher，catalog number: AM9906）
9. 醋酸纤维素(Aladdin ，catalog number:C106244-250g）
10. 酚/氯仿/异戊醇 (25:24:1) (Solarbio，catalog number:P1012)
11. 氯仿 (洛阳昊华化学试剂有限公司，catalog number:865-49-6)
12. 醋酸钠 (Ambion，catalog number:17888)
13. 乙醇 (天津市德恩化学试剂有限公司)
14. 冰乙酸 (天津市天力化学试剂有限公司)
15. 乳酸 (天津市瑞金特化学品有限公司)
16. 丙三醇 (洛阳昊华化学试剂有限公司)
17. 0.4%台盼蓝染色液 (Solarbio，catalog number:C0040)
18. PCR反应Mix Taq：2xEs Taq MasterMix (Dye) (康为世纪生物科技有限公司，catalog number: CW0690M)
19. ITS通用引物 (英潍捷基(上海)贸易有限公司)
20. DL2000 marker (宝日医生物技术(北京)有限公司, Takara，catalog number: 3427A)
21. 琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒 (赛默飞世尔科技有限公司)
22. pMDTM 19-T Vector Cloning Kit (宝日医生物技术(北京)有限公司, Takara，catalog number: 6013)
23. DH5α Competent Cells (CWBIO，catalog number: CW0808)
24. 酵母提取物 (OXOID, YEAST EXTRACT, catalog number: LP0021)
25. 胰蛋白胨 (OXOID, TRYPTONE, catalog number: LP0042)
26. 琼脂粉 (biosharp，catalog number: BS195-500g)
27. 琼脂糖 (英潍捷基(上海)贸易有限公司，Invitrogen, catalog number: 75510019)
28. ddH₂O
29. Cellulose acetate (Aladdin, C106244-250g)
30. 丙酮 (洛阳昊华化学试剂有限公司，31025)
31. TAE电泳缓冲液 (50x储存液，1 L) (见溶液配方)
32. LB固体培养基 (100 mL) (见溶液配方)
33. 醋酸纤维素 (500 mL) (见溶液配方)
34. 氨苄青霉素 (Solarbio，catalog number: A8180)
    

仪器设备

1. 多功能台式离心机(Beckman coulter，Allegra X-30R Centrifuge)
2. PCR 仪(Bio-Rad，C1000 TouchTM Thermal Cycler，S2015000932)
3. 电泳仪(Tanon，EPS-300，20132055)
4. 光照培养箱（上海精宏实验设备有限公司 (GZP, 350S) )
5. SIM-F140 制冰机 (SANYO，SIM-F140，04070077)
6. 蒸汽灭菌器 (Tomy Digital Biology，Tomy SX-500，16J-1085)
7. 海尔立式超低温保存冰箱 (青岛海尔集团，DW-88L388)
8. 移液器 (Eppendorf)
9. 摇床 (精宏，THZ-312，2003663)
10. 普通光学显微镜 (舜宇光学科技有限公司,Sunny Optical, EX30,04060092)
11. 核酸电泳仪 (WEALTEC, GES)
12. 制胶板 (WEALTEC, GES)
13. 电泳仪 (天能Tanon, EPS300)
    

软件和数据库

1. NCBI数据库 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)
2. MEGA-X (10.1.8, http://www.megasoftware.net/)

实验步骤