研究背景

丛枝菌根是球囊菌门真菌与植物根系组成的共生体系，是一类重要的内生菌根类型(Brundrett and Tedersoo, 2018)。丛枝菌根真菌(AMF)能够与陆地生态系统中大多数植物形成共生关系，帮助植物吸收N、P等矿质元素，提高植物生产力与抗逆性，此外还具有促进土壤水稳性团聚体的形成，改善土壤环境等生态学意义(Smith and Read, 2008)。AMF侵染植物后会在植物根皮层组织内形成典型的无隔膜的丛枝(arbuscule)、根内菌丝(intraradical hyphae)和泡囊(vesicle)结构，根外结构则包括土壤中的孢子(spore)和根外菌丝(extraradical hyphae) (Smith and Read, 2008)。其中，丛枝是AMF侵入植物根系皮层细胞后连续双叉分枝形成的类似树枝状的菌丝结构，是真菌与植物进行物质交换的重要场所，丛枝的卷曲结构增加了其物质交换的表面积，因此丛枝的侵染率常被用于评价AMF-宿主植物的共生状态。泡囊是根内菌丝末端膨大而成，富含脂类物质和碳水化合物等，约有80%的AMF可形成泡囊结构，其被认为是养分储存结构和繁殖器官。根内菌丝则负责传输营养物质，与植物和真菌的营养交换有关(Johnson et al., 2003)。根外菌丝在土壤中形成庞大的菌丝网络，主要是用于扩展AMF在土壤中的侵染空间以及吸收土壤中的矿质营养和水分(Miller, 1995)，此外，还参与土壤团聚体的构成，可提高团聚体的稳定性，改善土壤状况(Rillig, 2004)。孢子是AMF发育到一定阶段在根外菌丝上形成的厚壁无性繁殖器官，也是一些脂类的储藏结构(Smith and Read, 2008)。传统的AMF鉴定方法主要以孢子的形态特征为依据，许多科研工作者在这方面开展了大量研究并对AMF不同种属的孢子特征作了详细的描述，以网站的形式提供给研究人员参考 (http://invam.wvu.edu/) (Stürmer et al., 2021)，极大地方便了AMF的鉴定。然而孢子的产生受环境与宿主的影响，因此土壤中孢子的群落与植物根系中 AMF定殖情况有所差异，孢子计数往往不能真实反映植物根内AMF的群落结构和丰度的变化(Clapp et al., 1995)。随着分子生物技术手段的不断发展，高通量测序技术被广泛用于检测土壤或宿主根内的群落结构和多样性，但只能得到分子种，无法获得AMF菌株资源(刘永俊和冯虎元, 2010) ，且无法对其进行定量分析。而对AMF侵染效果(侵染率)和生物量(孢子密度、菌丝密度)的测定，不仅是菌根学研究中一项重要的基础性工作，同时也能够在一定程度上解决对AMF的定量问题。
本实验中，AMF侵染率测定基于染色镜检法，主要分为根系透明-染色-分色3个过程。关于染色方法目前国内外比较常用的有台盼蓝染色法和酸性品红染色法，而关于侵染率的统计方法主要有十字交叉法、根段侵染率加权法等。由于研究者所采用的方法不同，其结果也会存在差异。关于侵染率不同测定方法的比较可参考盛萍萍等(2011)人的文章。本文重点介绍采用台盼蓝染色和十字交叉法计算AMF侵染率。关于土壤中菌丝密度的测定同样也是基于台盼蓝染色和网格交叉法的原理，土壤中孢子的分离则是基于蔗糖密度梯度离心法的原理，采用湿筛倾析-蔗糖梯度离心法进行测定(Brundrett et al., 1994)。

材料与试剂

1. 组织包埋盒
2. 载玻片
3. 盖玻片
4. 移液枪头 (5 ml) 
5. 0.45 μm微孔滤膜
6. 100 ml离心管
7. 培养皿
8. 根际风干土壤
9. 新鲜根系
10. 10% KOH溶液
11. 蒸馏水
12. 自来水
13. 2% HCl溶液
14. 0.05% 台盼蓝 (乳酸:甘油:蒸馏水 = 1:1:1) 
15. 脱色液 (甘油:乳酸:蒸馏水 = 1:1:1) 
16. 45%-50%蔗糖溶液
    

仪器设备

1. 剪刀
2. 千分之一天平
3. 500 ml烧杯
4. 水浴锅
5. 镊子
6. 计数器
7. 光学显微镜
8. 高速粉碎机
9. 磁力搅拌机
10. 20目筛
11. 400目筛
12. 移液枪 (5 ml) 
13. 过滤器
14. 真空抽滤泵
15. 玻璃棒
16. 离心机（有效半径2.5 cm）
17. 体视镜
    

实验步骤