分析策略

一般而言，微生物16S rRNA扩增子的分析流程是从将测序序列数归一到同一测序深度，即Normalization开始的 (表1)。主流的Normalization是将测序序列进行抽平 (Jiao et al., 2015)，或者用R的DESeq包对序列数进行均一化 (Love et al., 2014; Weiss et al., 2017)。基于成分数据的Normalization是通过centered log-ratio (CLR) 将测序数据转化为比例数据 (Thorsen et al., 2016)，极大地降低了下游分析受测序深度的影响程度。下一步的分析通常是计算样品之间的β多样性 (PCoA)， 降维出图 (Ordination) 和多元比较 (Multivariate comparison)。主流的方法中这些分析是基于样品间的Bray-Curtis、UniFrac和Jensen-Shannon距离等 (Gloor et al., 2017; Weiss et al., 2017)。成分数据的下游分析是基于通过CLR计算的Aitchison距离，之后进行PCA (Principal Component Analysis) 降维，这可以最大程度地保证成分数据的降维是通过数据集中变异程度最大的zOTU实现的。主流的和基于成分数据的分析均通过ANOSIM、ADONIS等方式进行多元比较，来统计两组的微生物之间是否存在显著差异。最后，在筛选差异微生物 (如差异zOTU) 时，与主流流程通过LEfSe、DESeq2等不同的是，基于成分数据的差异zOTU分析是通过R包中的ANCOM和ALDEx2等来实现的 (Gloor et al., 2017; Weiss et al., 2017; Thorsen et al., 2016)。本流程最大的优势是可以极大程度降低测序深度对分析的影响程度，使得分析结果更准确可信。

表1. 微生物数据分析的主流和成分数据分析流程

软件

1. R (version 3.6.2)
2. R studio (https://github.com/rstudio/rstudio/)
   

输入数据

试验设计表格：conds.txt
zOTU表格：zotu.txt
zOTU注释信息表格：taxonomy.txt

实验步骤