RNA Virome and Bioinformatics Analysis

研究背景

致病性病毒的感染能够导致宿主疾病或死亡，严重危害公众健康，也会造成巨大的经济损失。然而，传统的病毒学研究手段在面临近年来频繁爆发的传染病时，表现出了明显的不足。一方面，从局部部位采集的样品，不足以反映病毒的整体情况，我们仅能从单一的点出发，对有限种类的病毒开展研究。另一方面，因为缺少合适的培养体系或动物模型，病毒学的基础研究困难重重。相比于其他疾病，以上这些不足极大地限制了我们对于病毒的研究，也使得病毒成为了当下研究最为不足的生物实体。
        "病毒组 (Virome)"是近年来兴起的一个新的组学概念，是指特定的生物个体、生物群体或生态环境中携带的所有病毒的集合，其包括DNA或RNA作为遗传物质的、已知或未知的、致病或非致病的、内源或外源的全部病毒。得益于高通量测序技术 (HTS) 的蓬勃发展，及其在病原生物学领域的广泛应用，病毒组的研究日益成熟并且一改传统的病毒学研究模式。人们不需要再颇费周章地寻找合适的病毒培养体系或模式动物，直接将感兴趣的样品构建成测序文库 (Library)，通过宏基因组 (Meta-genomics) 或宏转录组 (Meta-transcriptomics) 的测序方法便可以检测样品中的绝大部分病毒，从最宏观的视角剖析最微观的世界 (Shi et al., 2018; Zhang et al., 2018; Zhang et al., 2019)。
        高通量测序技术，又称"下一代测序技术 (NGS) "，是对传统的测序方法的革命性的变革，可以同时对高达数百万条的核酸分子进行序列测定，使得测序通量提高了成千万倍，也使得单一物种的基因组或转录组测序变得简单、快捷和便宜。高通量测序技术引领了多个生命科学领域的技术突破，有着广泛的应用。在病毒学研究当中，基于高通量测序技术的病毒组研究成为了人们认识病毒世界的强大工具。Zhang等人在他们的一篇评论中详细地介绍了利用宏基因组学、宏转录组学手段来拓展病毒圈 (Virosphere)，相比于其他传统方法 (病毒培养、共有引物PCR) 具有通量高、视角广等不可比拟的优势(Zhang et al., 2018)。
        2017年，ICTV宣布将通过宏基因组或宏转录组的方法发现的病毒加入正式的病毒学分类体系 (Simmonds et al., 2017)。高通量技术赋予了病毒学研究新的生机，自此人们发现和认识新病毒的过程进入了"快车道"。

材料与试剂

1. 3 mm研磨珠 (氧化锆) (武汉赛维尔生物科技有限公司，catalog number: G0203)
2. RNAlater (赛默飞世尔科技 (中国) 有限公司，catalog number: AM7021)
3. β-巯基乙醇 (1000x) (赛默飞世尔科技 (中国) 有限公司，catalog number: 21985 023)
4. 无水乙醇 (上海盛稀化工有限公司，catalog number: 64-17-5)
5. RNase-free ddH₂O (宝日医生物技术 (北京) 有限公司，catalog number: 9012)
6. DL2000 DNA Marker (宝日医生物技术 (北京) 有限公司，catalog number: 3427)
7. DL15000 DNA Marker (宝日医生物技术 (北京) 有限公司，catalog number: 358 2)
8. 50x TAE Buffer (翌圣生物科技 (上海) 有限公司，catalog number: 60116ES76)
9. 10x Loading Buffer (南京诺唯赞生物科技股份有限公司，catalog number: P022)
10. 高保真DNA聚合酶 (南京诺唯赞生物科技股份有限公司，catalog number: P505)
11. 逆转录试剂盒 (南京诺唯赞生物科技股份有限公司，catalog number: R323)
12. DNA提取试剂盒 (南京诺唯赞生物科技股份有限公司，catalog number: DC102)
13. RNA提取试剂盒 (南京诺唯赞生物科技股份有限公司，catalog number: RC101)
14. RNA文库构建试剂盒 (南京诺唯赞生物科技股份有限公司，catalog number: NR604)
15. 核糖体去除试剂盒 (南京诺唯赞生物科技股份有限公司，catalog number: N406/N407)
16. DNA纯化与分选磁珠 (南京诺唯赞生物科技股份有限公司，catalog number: N411)
17. RNA纯化磁珠 (南京诺唯赞生物科技股份有限公司，catalog number: N412)
18. 双端测序接头试剂盒 (南京诺唯赞生物科技股份有限公司，catalog number: N323/N324)
19. DNA定量试剂盒 (南京诺唯赞生物科技股份有限公司，catalog number: EQ121)
20. RNA定量试剂盒 (南京诺唯赞生物科技股份有限公司，catalog number: EQ211)
21. 高灵敏度DNA试剂盒 (安捷伦科技 (中国) 有限公司，catalog number: 5067-4626)
22. 高灵敏度DNA试剂 (安捷伦科技 (中国) 有限公司，catalog number: 5067-4627)

仪器设备

1. 移液器 (艾本德 (上海) 国际贸易有限公司)
2. 低温台式离心机 (赛默飞世尔科技 (中国) 有限公司)
3. 超低温冰箱 (赛默飞世尔科技 (中国) 有限公司)
4. 微量分光光度计 (赛默飞世尔科技 (中国) 有限公司)
5. Qubit荧光计 (赛默飞世尔科技 (中国) 有限公司)
6. 超净台 (北京东联哈尔仪器制造有限公司)
7. 研磨仪 (宁波新芝生物科技股份有限公司)
8. 琼脂糖凝胶电泳仪 (上海天能科技有限公司)
9. 凝胶成像仪 (上海天能科技有限公司)
10. 2100生物分析仪 (安捷伦科技 (中国) 有限公司)
11. PCR仪 (伯乐生命医学产品 (上海) 有限公司)
    注：另需工作站 (型号：DELL Precision T7920；系统：Ubuntu 20.04；CPU: Intel (R) Xeon (R) Gold 6140 CPU @ 2.30 GHz，36核)，用于运行相关命令；普通个人电脑，用于调用个人终端、以及访问网页版软件和下载序列。
    

软件和数据库

1. Python v3.8.5
2. Miniconda v4.9.2
3. FastQC v0.11.9
4. Trimmomatic v0.39
5. Trinity v2.1.1
6. DIAMOND v2.0.4
7. ORFfinder v0.4.3
8. IBS v1.0.3
9. MAFFT v7.453
10. trimAL v1.2.rev59
11. MEGA 7 v7.0.26
12. IQ-TREE 2 v2.1.1
13. FigTree v1.4.4
14. Cytoscape v3.8.1

实验步骤