Improve Research Reproducibility A Bio-protocol resource

功能基因高通量定量方法

High-Throughput qPCR Assays for Functional Genes

安 安新丽
栗 栗利娟
周 周昕原
黄 黄福义
朱 朱永官
苏 苏建强

发表时间: 2021年04月27日 DOI: 10.21769/BioProtoc.2003735 浏览次数: 3530

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微生物组实验手册：架起各领域通向微生物组世界的桥梁
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摘要：高通量定量PCR的原理是在模板DNA的PCR反应体系中加入荧光基团，进行高温变性，低温复性，适温延伸的热循环聚合酶链式反应。高通量定量PCR包括染料法和探针法，其通过荧光信号实时监测PCR反应进程，实现荧光信号积累与PCR产物形成同步，进而求得Ct值，获得扩增曲线和溶解曲线。同时利用已知模板浓度的标准品做对照，进而获得未知样本目的基因拷贝数。功能基因高通量定量PCR方法是基于日本TAKARA公司SmartChip微孔芯片可进行高通量、高密度、纳升级别的实时定量PCR的方法。高通量定量PCR需要采用纳升级多样品自动加样器将样品分配到微孔芯片上，并通过高密度实时定量PCR仪收集荧光信号，获得Ct值。微孔芯片一次运行可以进行5184个独立扩增反应，单孔反应体系仅100 nL，规避了以往传统qPCR方法的基因检测单一化、费用成本高和效率低等缺点。该方法具有高通量、低样本量、低成本、周期短、操作简单等优势，可广泛适用于各种环境样本，例如水体(湖泊、海洋、污水、地下水等)、土壤、植物、沉积物、粪便、气溶胶颗粒等样品的功能基因标志物的精确定量和SNP基因分型等。

Keywords: 高通量荧光定量 search 标准曲线 search 绝对丰度 search 微孔芯片 search

材料与试剂

  1. 各种型号吸头(Mettler Toledo company，Rainin，RC LTS)
  2.  SmartChip MyDesign Chip(s) (Takara Biomedical Technology，Clontech，640032)
  3.  384方孔板和封板膜 (Thermo Fisher，Thermo Scientific Nunc，264573)
  4.  无菌平底96孔板(Thermo Fisher，Thermo Scientific Nunc，174897)
  5.  LightCycler 480 SYBR Green I Master (Roche，4887352001，-20°C避光保存，保质期通常6个月)
  6.  High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor (Life Technologies，4374966，-20°C避光长期保存)
  7.  无核酸酶的PCR级水(任意供应商)
  8.  一次性无菌加样槽 (Corning，Costar 4870)
  9.  PCR引物对及探针(任意供应商)
  10.  TaqMan® Gene Expression Master Mix(Life Technologies，4369016，4°C避光保存)
  11. 无核酸酶的1X TE buffer pH 8.0(任意供应商)
  12. ROX参比染料 (50X) (Life Technologies，12223-012)
  13.  牛血清蛋白BSA (Sigma，A1933)
  14.  0.2 ml, 1.5 ml和2ml离心管 (Axygen，MCT-150-C，MCT-200-C)
  15. Invitrogen Qubit dsDNA HS Assay (Thermo Fisher，Invitrogen,Q32851)

仪器设备

  1.  SmartChip Mμltisample Nanodispenser (Takara Biomedical Technology)
  2.  SmartChip Cycler(Takara Biomedical Technology)
  3.  离心机 (Eppendorf，5424 R，5430)
  4.  荧光定量PCR仪(Roche，LightCycler480II)
  5.  超纯水 (任意供应商)
  6.  氮气瓶(任意供应商)
  7.  移液器 (Eppendorf，3120000909，3122000035，3122000051)
  8.  Vortex蜗旋仪 (Scientific Industries，Vortex-Genie 2，SI-0246 (G560E))
  9.  Qubit 4.0荧光定量仪(Thermo Fisher，Q33226)

实验步骤

Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式：安新丽, 栗利娟, 周昕原, 黄福义, 朱永官, 苏建强. (2021). 功能基因高通量定量方法. // 微生物组实验手册. Bio-101: e2003735. DOI: 10.21769/BioProtoc.2003735.
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How to cite: An, X. L., Li, L. Y., Zhou, X. Y., Huang, F. Y., Zhu, Y. G. and Su, J. Q. (2021). High-Throughput qPCR Assays for Functional Genes. // Microbiome Protocols eBook. Bio-101: e2003735. DOI: 10.21769/BioProtoc.2003735.
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分类

系统生物学 > 微生物组学

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