DNA-Stable Isotope Probing and Metagenomics Binning

基本原理

1. 稳定同位素示踪原理
   在碳同化培养体系中添加含¹³C的标记物与微生物共培养。该过程中微生物如果可以利用标记物进行同化作用，则可将¹³C合并至自身DNA，从而完成对目标功能菌群的“标记”。然后收集样品总DNA，利用超速离心机分离。由于浮力密度的不同，¹³C-DNA主要分布在底层（重层），未被标记的¹²C-DNA则主要分布在上层（轻层）（图1）。重点收集重层DNA进行下游的高通量测序及生物信息学分析（图2）。
   
   
   图1 DNA-SIP分层示意图。 (图片来自网络)
   
   
   图2 DNA-SIP与生物信息学分析联用的流程示意图。(图片来自网络)
   
   
2. 宏基因组分箱原理
   宏基因组分箱（Binning）基于宏基因组原始测序序列，可进一步将其中混合了不同微生物的序列或序列组装得到的contigs按物种进行分类（图3）。提取个体基因组草图(bins)可以实现宏基因组的单菌基因组水平分析。以往传统的单物种全基因组序列都是对目标菌群经过纯培养后，方能进行全基因组de novo测序。但是环境中存在着大量的不可培养微生物，Binning技术不依赖培养条件就可获得微生物的全基因组序列，从而获得新物种的基因组序列和代谢功能等生物信息。
   
   
   图3 宏基因组分箱原理示意图。（Kang et al.,2015）
   

材料与试剂

1. 普通¹²C乙酸 (北京百灵威科技有限公司，Lot: LE10Q200)
2. ¹³C乙酸 (Cambridge Isotope Laboratories,Inc，Lot: PR-29445)
3. DNA提取试剂盒(QIAGEN GmbH，Lot: 163046382)
4. qPCR试剂盒 (Takara，Lot: AJ91708A)
5. 氯化铵 (广州化学试剂厂)
6. 十二水合·磷酸氢二钠 (麦克林，Lot: C11160473)
7. 磷酸二氢钾 (广州化学试剂厂)
8. 氯化镁 (广东光华科技有限公司，Lot: 20190404)
9. 刃天青 (北京百灵威科技有限公司)
10. TE buffer (ZOMANBIO，Lot: 9BB08S)
11. 氯化铯 (BIOBOMEI，Lot: B23V1019)
12. 无水乙醇 (阿拉丁)
13. 核酸助沉剂 (ZOMANBIO)
    

仪器设备

1. 掌上离心机 (Scilogex)
2. 专用离心管 (Eppendorf Centrifuge 5430 R)
3. 超高速离心机 (Beckman Optima MAX-TL)
4. Qubit定量 (Thermo Fisher Scientific)
5. qPCR仪 (BIO-RAD CFX96 Real-Time System)
6. DNA裂解仪 (MP Biomedicals FASTPREP-24)
7. SIP分层泵 (Beckman)
8. 真空浓缩仪 (Eppendorf)
9. 振荡器 (Silentshake)
10. 折光率仪 (Atago)
    

软件和数据库

1. QIIME2 (扩增子分析主流软件)
   系列教程：https://docs.qiime2.org/2020.11/
2. Megahit宏基因组组装软件
   安装：conda install -y megahit
   使用：time megahit -t 30 \
   -1 `ls 质控后序列路径/File_1.fq|tr '\n' ','|sed 's/,$//'` \
   -2 `ls 质控后序列路径/File _2.fq|tr '\n' ','|sed 's/,$//'` \
   -o YOUR PATH/megahit --k-min 21 --k-max 121 --k-step 10
   官方文档：《MEGAHIT: an μltra-fast single-node solution for large and complex metagenomics assembly via succinct de Bruijn graph》Bioinformatics, 2015.
3. MetaWRAP宏基因组分箱软件
   安装：conda install -c ursky metawrap -mg
   使用：metawrap binning -o resμlts/01_binning -t 30 -a YOUR PATH TO/final.contigs.fa \
   --metabat2 --maxbin2 --concoct YOUR PATH TO指控后序列/File_clean_*.fastq
   官方文档：《MetaWRAP—a flexible pipeline for genome-resolved metagenomic data analysis》Microbiome, 2018.
4. Kneaddata质控软件
   安装：conda install -y kneaddata
   使用：time kneaddata -i seq/sample_1.raw.fq.gz -i seq/ sample _2.raw.fq.gz \
   -o temp/qc -v -t 30 --remove-intermediate-output \
   --trimmomatic ~/miniconda2/envs/metagenome_env/share/trimmomatic/
   --trimmomatic-options 'SLIDINGWINDOW:4:20 MINLEN:70' \
   --bowtie2-options "--very-sensitive --dovetail" -db YOUR PATH TO/db/bowtie2'
5. Prokka 细菌基因组注释
   安装：conda install -y prokka
   使用：time prokka YOUR PATH TO/megahit/final.contigs.fa --outdir temp/prokka \
   --prefix mg --metagenome --kingdom Archaea,Bacteria,Mitochondria,Viruses \
   --force --cpus 30
   官方文档：《Prokka: rapid prokaryotic genome annotation》Bioinformatics, 2015.
6. Salmon基因定量工具
   安装：conda install -y salmon
   使用：time parallel -j 3 \
   'salmon quant -i temp/salmon/index -l A -p 40 --meta \
   -1 YOUR PATH TO指控后序列/File_clean_1.fastq \
   -2 YOUR PATH TO指控后序列/File_clean_2.fastq \
   -o temp/salmon/Sample_output.quant'
   官方文档：《Salmon: fast and bias-aware quantification of transcript expression using dual-phase inference》Nature Methods, 2017.
   

说明

1. 本文以最简单的乙酸降解功能菌分析流程进行介绍，读者可根据实际需要将标记物由¹³C乙酸替换成其他标记物，如¹³C乳酸、¹³C碳酸氢钠、¹³C甲苯等。
2. ¹³C标记物建议直接购买商用产品。
3. 本文描述的¹²C标记物即为普通试剂。
4. 以下实验操作中所用的枪头、离心管、西林瓶等耗材均需经过高压灭菌处理。
   

实验步骤